【摘要】：我国人群乙型肝炎病毒(HBV)的携带率为7.18%,给血液安全工作带来了巨大的挑战。限于检测方法的技术局限性,血液筛查常用的酶联免疫检测(ELISA)技术存在一定程度的漏检,尤其是对处于感染“窗口期”、变异病毒株感染,免疫静默感染或隐匿性感染等情况下的样本。HBV的隐匿性感染(OBI)状态,是排除感染窗口期的情况下,由于某种原因导致感染者体内HBsAg表达减少或者突变而表现为HBsAg"DNA+。对于OBI,现有的HBsAg筛查显然无能为力,为此核酸检钡(NAT)被广泛应用于血液筛查。但是近年来的研究表明,即使使用NAT血液筛查,对于OBI的病例仍存在一定的漏检风险。为进一步保障血液安全,亚甲蓝光化学法(MB-P)已广泛应用于血浆病毒灭活,其原理是在光能量作用下,亚甲蓝分子受到激发,破坏血液成分中病原体结构,使其不再具有感染活力。已知MB-P灭活作用的靶位点主要是病毒的核酸和包膜,对血液中的脂质包膜病毒和某些非脂质包膜病毒都有一定的灭活作用,但是其灭活机理,尤其是灭活作用对HBV分子结构的影响还有待进一步阐明。本文将从血液安全出发对OBI形成和MB-P对HBV的作用机理两方面进行初步探讨。 第一部分,了解OBI在上海地区无偿献血人群中的流行状况,并分析HBV DNA载量、HBV血清标记物的状态、HBV基因型和S区氨基酸的突变情况与OBI的关系,以推测OBI形成的可能原因,为改进HBV的筛查方法和减少HBsAg的漏检提供依据。研究中,收集了上海市血液中心2011年10月至2012年7月期间无偿献血者初筛合格血液样本,使用核酸检测进行定性和定量分析,对HBsAg-DNA+的样本进行HBV五项血清标记物的检测,然后抽提DNA,应用巢式PCR法进行S区扩增、克隆测序、基因分型和突变分析。结果发现250360例无偿献血样本中有197例HBsAg-DNA+这些样本的HBV DNA定量范围为0～7.11×1031U/ml,其中48.78%的样本DNA载量低于100IU/ml。对197例样本进行HBV血清学乙肝五项检测,其中25例(25/197,12.7%)血清学标记物全部为阴性,推测可能为HBV窗口期或者原发性OBI,需随访定论。172例(172/197,87.3%)为HBcAb+或HBsAb+样本,确认为OBI。因此得出上海地区无偿献血人群中OBI的流行率为0.069%(172/250360),低于国内其他地区。对47/172例OBI样本进行S区突变分析,17例经巢式PCR扩增出S区,扩增效率为36.17%(17/47),其中14例为C亚型,突变率为35.71%(5/14)；3例为B亚型,突变率为33.33%(1/3)。可见OBI病例中HBV C亚型显著高于B亚型,这与其他文献报道一致。发现常见的突变位点126aa和130aa,可能与OBI的形成有关。OBI样本中HBV DNA的低载量对NAT血液筛查的灵敏度提出了更高的要求,提示即使开展NAT血液筛查,仍可能有部分OBI样本漏检。 第二部分,研究了MB-P灭活后HBV对小鼠的免疫作用,以期进一步探讨MB-P灭活机理,为该方法在进一步降低感染性输血风险中的应用提供理论依据。鉴于MB-P对病毒核酸的作用机理已经阐明,且MB-P病毒灭活效果已经实验室、动物模型以及临床验证,本研究拟对报道较少的MB-P对HBV包膜抗原性的影响进行初步探讨。选择有HBV复制的HepG2.2.15细胞的培养上清,经蔗糖梯度离心法和超滤管离心法浓缩纯化上清液中的HBV,并以HepG2细胞上清作为对照,经MB-P灭活后,ELISA法检测HBsAg和HBeAg,初步发现其抗原性仍然存在。使用灭活后的HBV刺激PBMC,3d后发现IFN-y分泌量显著增加。之后使用动物模型从体液和细胞免疫两方面,探讨灭活HBV对小鼠的免疫作用。使用灭活后的HBV每两周经皮下和腹腔多点免疫注射小鼠,共免疫四次。初次免疫后,每次免疫前和末次免疫后20天小鼠眼眶后静脉丛采血,共采血4次,收集血清,ELISA测定HBsAb量,发现抗体随时间而增加,在第四周时抗体普遍大于10mlU/ml,因此确定其能够引起小鼠的体液免疫反应。随后从Th1/Th2平衡、特异性T细胞增殖和杀伤能力三方面探讨其激起细胞免疫的作用。在末次免疫20d后,摘除眼球取血,流式细胞仪检测到小鼠Th1/Th2细胞因子(IL-2,IL-4,IL-5,IFN-γ,TNF)显著增加。同时无菌取脾脏,CTL细胞杀伤实验显示小鼠HBsAg特异性细胞杀伤能力显著高于对照组,但MTT法未发现有明显的增殖。实验结果表明,虽然MB-P法能破坏HBV核酸,使HBV失去感染活性,但该方法对HBV的免疫原性没有影响,相反,注射经灭活后的HBV能提高小鼠的体液和细胞免疫,这一发现有助于更进一步地了解MB-P的作用机理。
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【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62
【参考文献】
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