Cbl-b在丙型肝炎患者T细胞失能中的作用机制研究

发布时间：2019-04-09 14:25

【摘要】：根据世界卫生组织2010年的数据，全球大约有1.7亿人感染了丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV）。感染HCV后，约有75-85%的患者进展为慢性肝炎。其中至少20%的感染者在未来20年内发展为肝硬化或肝癌[1]。在欧洲和南美洲，20-30%的肝移植患者是因感染HCV感所致[2]。目前尚无有效的HCV疫苗，注射干扰素加口服利巴韦林等治疗措施的有效性也只有50%左右，且会出现各种副作用，更重要的是我们尚未明确HCV的逃逸致病机制[3]。因此，我们必须尽可能的将其研究清楚，以便我们制定出更加有效的治疗方案。趋化因子是一类小分子分泌性蛋白质，可吸引中性粒细胞、单核/巨噬细胞等炎性细胞移动到炎症部位，增强炎性细胞的吞噬杀伤功能，参与免疫调节和病理损伤。趋化因子C-X-C配体（chemokine C-X-C ligand, CXCL）属α趋化因子，其结构中含有保守的半胱-X-半胱（C-X-C）基序，主要激发中性粒细胞趋化性。其中，CXCL9又称为“γ干扰素诱导的单核细胞因子（monokine induced by gamma interferon,MIG）”，是T细胞趋化因子；CXCL11又称为“干扰素诱导的T细胞α趋化因子（Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant, I-TAC）”，结合CXCR3，对活化的T细胞、中性粒细胞和单核细胞发挥趋化作用。研究发现HCV患者血清中趋化因子CXCL9、CXCL11水平升高，可与T细胞上受体CXCR3结合后，有助于将T细胞募集至HCV病毒感染部位，发挥细胞免疫应答，有助于清除HCV病毒；且有研究证实，慢性肝炎患者CD4+T和CD8+T细胞高表达组织归巢受体（CD161），与趋化因子受体水平呈正相关，也进一步证实T细胞被趋化因子募集至肝脏。然而仍有75-85%HCV感染者发生慢性化，提示募集至肝脏中的T细胞没有发挥有效的免疫应答，将HCV病毒清除；一系列研究证实HCV感染者T细胞处于失能状态，导致T细胞失能的因素有多种，近期大量研究发现E3泛素连接酶Cbl-b是近年发现的首个直接参与T细胞活化和耐受的E3泛素连接酶。在很多感染性疾病中Cbl-b都发挥负调控作用，而目前尚未见有关Cbl-b在慢性丙型肝炎中的相关报道。因此，本实验拟通过探索Cbl-b在T细胞失能中的作用及规律，进一步阐明HCV感染时T细胞失能的机制，为抗HCV治疗提供新的思路和方法。 1．血清趋化因子CXCL9和CXCL11的检测采取健康人和丙肝患者全血,2h内进行处理，吸取上层血清标本冻存于-80℃超低温冰箱中备用。应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清CXCL9和CXCL11。 2．外周血Cbl-b、CD28和CTLA-4的表达的检测采取健康者和患者的外周血，分离出外周血单个核细胞（PBMC），将细胞调至5×106个／mL，参照美国Invitrogen公司的Trizol试剂说明提取总的RNA并定量。用1gRNA反转录，再加入引物用PCR试剂盒扩增目的基因。 3．Cbl-b腺病毒载体的构建和包装将Cbl-b基因定向插入到腺病毒穿梭质粒pAV.EX1d-CMV中，获得重组质粒pAV.Ex1d-CMVCBL-B/IRES/EGFP，再转染HEK293细胞,包装腺病毒表达载体。用不同方法检测腺病毒载体。通过酶切、PCR及测序对穿梭质粒进行了鉴定。结果： 1．健康对照组血清CXCL9、CXCL11的浓度低于慢性丙型肝炎组，差异均具有统计学意义（P0.05）。在慢性丙型肝炎组内，CXCL9和CXCL11的水平在不同HCV1b基因型组和2a基因型组之间无显著差异。CXCL9和CXCL11浓度与血清ALT水平无相关性，与HCV RNA载量也无相关性。 2．Cbl-b、CD28和CTLA-4mRNA在慢性丙型肝炎患者中较健康对照组表达升高，其中CTLA-4的升高表达具有统计学意义；在HCV lb基因型中，Cbl-b和CTLA-4mRNA水平较HCV2a基因型显著升高，差异具有统计学意义，而这三个分子与HCVRNA和ALT水平均无显著统计学意义。 3．经酶切及PCR鉴定，Cbl-b腺病毒载体构建成功，进一步研究Clb-b在HCV感染中的作用机制奠定了基础。综上所述，，Cbl-b在丙型肝炎患者T细胞失能中可能起到了负性调节作用，具体机制仍需进一步的研究和探索。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.63

【参考文献】