结核分枝杆菌噬菌体SWU1多糖解聚酶基因A321gp39的克隆表达及其功能的研究

发布时间：2019-04-22 18:29

【摘要】：结核病是一种危害人类公共健康的重大传染性疾病。结核病的致病菌是结核分枝杆菌。近年来,由于全球艾滋病的流行、人口流动性的增加、耐多药菌株的出现,使全球结核病疫情进一步加重,全世界每年约有三分之一的人口感染结核分枝杆菌,约有两百万人死于结核病,结核病已成为仅次于艾滋病的第二大致死性感染性疾病。目前,治疗结核病的方法主要是传统的化学治疗方法,如异烟肼,利福平等,但随着其耐药性的增加导致这些药物的治疗效果越来越不理想,因此急需开发新型有效的快速诊断和治疗方法。噬菌体是一种细菌的病毒,能够特异性的感染宿主细菌。多糖解聚酶是一种由噬菌体编码产生的具有降解荚膜多糖以及宿主胞外多糖的大分子碳水化合物的酶类。目前已知的大多数噬菌体属于有尾噬菌体或者有尾噬菌体目,属于C群噬菌体组。这些噬菌体在感染被荚膜包裹的某些宿主细菌的过程中,可在噬菌斑的外部形成一个圆形的晕环状晕圈,这些晕圈的形成可能是由于在感染的过程中,噬菌体产生的大量的多糖解聚酶在琼脂平板上扩散并将噬菌斑周围的宿主菌降解造成的。研究发现这些多糖解聚酶的形成可能与噬菌体的尾部刺突结构有关。目前已经在铜绿假单胞菌噬菌体、肺炎克雷伯氏菌噬菌体、酿脓链球菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体等中发现有噬菌体多糖解聚酶的存在。这些酶主要包括降解细菌细胞壁肽聚糖层骨架的一些内溶素裂解酶、降解细菌脂多糖O抗原的内鼠李糖苷酶以及降解细菌荚膜多糖的海藻酸裂解酶和内唾液酸酶等。但目前还未有报道在结核分枝杆菌噬菌体中发现有这种解聚酶活性的裂解酶。 SWU1是一株新分离的结核分枝杆菌噬菌体。该噬菌体形成的噬菌斑具有独特的结构特征。其噬菌斑形态为在噬菌斑的外部形成一个环形的晕环状晕圈,在噬菌斑的中心产生一个浑浊的区域,这种噬菌斑特征与产生解聚酶噬菌体的噬菌斑特征相一致。本文使用MEGA4软件对与SWU1同源的噬菌体进行构建进化树,结果显示SWUl噬菌体与一种温和型的L5噬菌体具有较高的亲缘性,其噬菌体基因组相似度高达80%,但L5并不形成晕环状噬菌斑。因此为了寻找两种噬菌体形成不同噬菌斑的原因,对SWUl与L5噬菌体基因组进行比较,发现在SWU1噬菌体的基因组中存在着一个特殊的基因即A321gp39。其在NCBI中注释为利什曼溶样蛋白肽(leishmanolysin-like peptidase),其氨基酸序列比对发现其与大肠杆菌4_1_40B噬菌体(Escherichia sp.4_1_40B phage)的尾部刺突蛋白(Tailspike Protein,TSP)具有一定的相似性(相似度为41%)。HHpred分析结果显示,其N末端具有一个糖苷水解酶催化活性中心。因此,推测其可能是一种多糖水解酶,并且可能参与SWUl噬菌体外部环形晕圈的形成。这里我们克隆表达了A321gp39基因,并纯化出了A321gp39的蛋白。实验结果表明,A321gp39具有降解耻垢分枝杆菌菌苔和耻垢分枝杆菌生物膜多糖的活性。此外,成功构建了M.s-pALACE-A321gp39的重组耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE和Western-Blot检测其在耻垢中稳定表达。与M.s-pALACE空载耻垢分枝杆菌相比,A321gp39蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达不仅抑制了耻垢的滑动能力,并对多种抗生素表现出了敏感性。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R52

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