复苏促生长因子结构域及其突变体蛋白诱导小鼠免疫应答的研究

发布时间：2019-04-24 17:13

【摘要】：结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一种古老而漫长的感染性疾病，由其导致的死亡率居全球第二位，给各国尤其是发展中国家带来了沉重的负担。据世界卫生组织(world health organization,WHO)统计，2007年全球新增结核病人937万，因TB死亡人数达132万(不包括HIV阳性患者)。新增病例中亚洲和非洲分别占55%和31%，其中中国以130万新增病例位居第二位，TB防控形势非常严峻。目前，卡介苗(Bacillus Calmette G uerin，BCG)是唯一一种获得批准的广泛使用的TB预防疫苗，对于儿童BCG具有良好的保护效果，但对于成人其保护效果不容乐观，对于抑制潜伏期结核的复发更是毫无作用。新发TB患者主要来源于潜伏MTB感染者，，原因在于休眠状态MTB的再激活和复苏，因此研制新的TB疫苗迫在眉睫。未来的TB疫苗不仅要对刚出生婴儿以及未感染MTB的人群提供良好的预防作用，对于已感染MTB但尚未发病的人群也要具有增强细胞免疫、加速清除MTB的保护作用。 1.目的检测藤黄微球菌复苏促生长因子结构域（Resuscitation-promoting factor domain，Rpfd）及其两个突变体（Rpfd1、Rpfd2）刺激小鼠体内产生特异性抗体及γ干扰素（Interferon γ，IFN-γ）和白细胞介素-2（Interleukin2，IL-2）水平，以评价三种因子的免疫原性。 2.实验方法和结果 2.1Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白纯化、鉴定将前期制备含谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase， GST）基因片段重组质粒PGEX-4T1-Rpfd、PGEX-4T1-Rpfd1、PGEX-4T1-Rpfd2已转入E. coliDH5α中的感受态细胞进行活化、转接、诱导，获取表达产物蛋白，将表达产物蛋白进行纯化。应用Western-blot方法进行蛋白鉴定，鉴定所表达的蛋白为所需目的蛋白。测定蛋白浓度分别为：Rpfd1.400mg/ml、Rpfd12.438mg/ml、Rpfd23.882mg/ml。 2.2Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白诱导小鼠体内的体液免疫应答将Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加强免疫的方法免疫小鼠，测定其在小鼠体内诱导产生的特异性抗体水平。实验结果表明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白均具有很好的免疫原性，能在小鼠体内产生高效价的抗Rpfd特异性抗体，且三种抗原刺激产生的抗体效价显著高于BCG免疫组。其中Rpfd2组产生的抗体水平最高，提示其启动感染宿主体液免疫能力优于BCG。使用Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白作为抗原，均能被3种抗体识别，且亲合程度趋于一致，说明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白产生的特异性抗体同Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白之间存在交叉免疫反应，提示该三种蛋白产生的特异性抗体有可能同时封闭MTB的5种Rpf样蛋白，从而达到抑制休眠MTB复苏和生长作用。 2.3Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白诱导小鼠体内的细胞免疫应答将Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加强免疫的方法免疫小鼠，测定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表达水平。用MTB毒株H37Rv攻击免疫小鼠，测定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表达水平。结果显示Rpfd、Rpfd1、Rpfd2具有诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量明显增加为主的Th1型免疫应答。H37Rv攻击小鼠后，Rpfd发挥其促细菌生长作用，使小鼠体内MTB大量生长，巨噬细胞吞噬大量MTB后，崩解死亡导致IFN-γ含量明显下降；而Rpfd1、Rpfd2无促细菌生长作用，巨噬细胞吞噬MTB后，未达到结核菌负荷过载，巨噬细胞杀灭MTB，同时促进IFN-γ分泌，故IFN-γ量增加。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白免疫小鼠后，刺激小鼠产生IL-2水平明显升高，高于BCG免疫组；MTB攻击免疫小鼠后，三组蛋白免疫组小鼠血清中IL-2检测量均有下降，Rpfd2蛋白免疫组小鼠血清中IL-2下降尤为明显，提示IL-2因刺激机体内T淋巴细胞增殖，强化细胞保护性免疫而消耗，Rpfd2组更为明显。 3结论 Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具有启动宿主体液免疫功能及增强宿主细胞免疫功能的双重作用，可通过激发宿主细胞免疫防御MTB的感染，通过刺激机体产生特异性抗体封闭体内或体外来源的Rpf样物质、从而抑制体内处于休眠状态的MTB的复苏，可成为预防及治疗MTB感染的免疫新策略。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R52

【参考文献】