上调宿主microRNA-203对血吸虫病肝纤维化的影响

发布时间：2019-06-03 15:53

【摘要】：血吸虫病是一种严重威胁人类生命健康的寄生虫病，广泛流行于亚洲、非洲和拉丁美洲。寄生于人体的血吸虫主要有6种，我国仅有日本血吸虫流行。至09年底，我国仍有血吸虫病流行县（市、区）454个，全国血吸虫病人约36万例。血吸虫病的病理基础是宿主对血吸虫成体和成熟虫卵释放的可溶性虫卵抗原产生的免疫应答反应。血吸虫感染早期，Th1反应被适度激活，从而抵御在宿主体内迁移的童虫和在肠系膜静脉中定植的成虫。Th1反应以TNF-α、IL-1、IL-6和IFN-γ等细胞因子的水平升高为特征。随着虫卵在宿主组织中沉积，机体的免疫反应快速转变为Th2反应，Th2反应以IL-4、IL-13、IL-10等细胞因子的水平升高为特征。血吸虫虫卵引起的肝脏肉芽肿和纤维化病变是导致血吸虫病患者死亡的主要原因。肝纤维化是肝肉芽肿的继发性病变，过多的胶原蛋白沉积在肝组织将阻塞肝内血流，引起腹水、脾脏肿大和食管胃底静脉曲张等门脉高压症状。在各种肝纤维化动物模型和导致人类肝纤维化的疾病中，激活的肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSC）被认为是肝纤维化的主要效应细胞和肝组织中沉积的胶原蛋白的主要来源。静止状态的HSC位于肝组织窦周间隙，是肝脏储存维生素A的主要载体。在多种病理因素作用下，，静止型的HSC可转分化为肌成纤维细胞，迁移能力增强，分泌胶原蛋白增多，并能分泌多种促纤维化因子，引起肝纤维化。很多研究表明，HSC在血吸虫病肝纤维化过程中也发挥了重要作用。因此，阻止HSC的激活或抑制HSC的活性可能能够阻止血吸虫病肝纤维化的发生、发展。微小RNA（microRNA, miRNA）是一类高度保守的，在转录后水平调控基因表达的非编码小RNA分子。动物细胞中的miRNA主要可通过种子序列与靶基因的3’端非翻译区的互补序列结合，抑制靶基因的翻译过程，从而调控一系列生理病理过程，包括机体的生长发育、细胞增殖与分化、凋亡、信号转导、肿瘤发生等过程。研究表明miRNA在多种因素如感染、乙醇或化学因素持续存在、代谢性疾病等引起的肝脏疾病的发生发展中发挥重要的调控作用。miRNA在肝纤维化中的作用也有所报道。HSC是肝纤维化的主要效应细胞，研究表明miRNA直接参与了HSC的激活、HSC活化后的凋亡、HSC胶原蛋白的合成等重要过程。这些研究不仅能帮助我们更好的理解肝纤维化的发生机制，更有助于寻找减缓甚至逆转肝纤维化的新靶点。然而，miRNA是否在血吸虫病肝纤维过程中发挥作用及其分子机制还有待于研究。本实验室前期完成了血吸虫感染后不同时间点小鼠肝脏miRNAs生物芯片分析工作，动态观察了miRNAs在血吸虫病肝纤维化过程中的变化，结果显示了miR-203在血吸虫病肝纤维化过程中发生了表达下调，在血吸虫感染后第42、49、56、和70天分别达到了0.49、0.33、0.41、0.48。本课题是在此基础上，通过Real-time PCR的进一步验证，发现miR-203在血吸虫感染后第42、49、56、70和84天，分别是未感染组的0.47、0.23、0.31、0.18和0.40，经初步生物信息学分析，确定了以miR-203及其在小鼠血吸虫病肝纤维化过程中的作用为研究内容。本课题通过腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴，建立了血吸虫病肝纤维化小鼠模型。以8型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV8）为载体，构建了特异性表达pri-miR-203的重组腺相关病毒载体（rAAV8-pri-miR-203）。小鼠在感染血吸虫后第10天尾静脉注射rAAV8-pri-miR-203以上调小鼠肝脏组织中miR-203的表达。通过与对照组比较，观察特异性上调肝脏中miR-203对小鼠生存时间、肝脏虫卵肉芽肿和纤维化的影响，进而确定miR-203在血吸虫病肝纤维化中的功能及机制。具体方法和结果如下： 1.芯片结果的验证：采用前期芯片检测所用的小鼠肝脏样本，即日本血吸虫感染后第10、26、35、42、49、56、70和84天肝脏样本以及未感染组肝脏样本，重新抽提总RNA，逆转录为cDNA，用real-time PCR方法检测miR-203在各时间点的表达水平。结果显示，RT-PCR检测的miR-203表达水平与芯片结果基本一致，在血吸虫感染后第42、49、56、70和84天肝组织中，miR-203的表达明显下调，分别是未感染组的0.47、0.23、0.31、0.18和0.40。 2.上调miR-203表达对血吸虫感染小鼠生存期的影响：小鼠感染致死量的日本血吸虫尾蚴（30条），并在感染后的第10天通过尾静脉注射6×109rAAV8-pri-miR-203或等体积的PBS，在80天的观察时间内记录各组小鼠的生存时间。结果显示，通过注射rAAV8-pri-miR-203载体上调肝脏中miR-203表达的6只小鼠，4只在观察期内存活，另外2只小鼠分别在感染后59和74天死亡，而PBS组5只小鼠在感染后第54至65天期间内相继死亡，另外1在观察期内存活。两组小鼠生存时间差异显著（P＜0.05）。 3.上调miR-203表达及其对血吸虫病肝纤维化的影响：通过腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（16条），建立了血吸虫病肝纤维化小鼠模型，并在感染后的第10天通过尾静脉注射5×109rAAV8-pri-miR-203或等体积的PBS，通过与对照组比较，观察特异性上调肝脏中miR-203后小鼠肝纤维化、肝细胞损伤、肠道粘膜屏障损伤、及机体Th1/Th2免疫反应等相关指标并选择在感染后第42、56和70天检测上述指标。结果显示，rAAV8-pri-miR-203组小鼠显著提高肝脏中miR-203的表达，在感染后第42和56天其表达水平是未感染组的7.69和2.18倍，并呈显著性差异（P＜0.01）。但随后miR-203表达呈下降趋势，至感染后第70天rAAV8-pri-miR-203组小鼠miR-203的表达（0.67±0.10）与PBS组（0.53±0.13）相比无显著性差异，P＞0.05。 rAAV8介导的上调肝组织miR-203的表达对血吸虫病肝纤维化的影响如下：（1）小鼠肝组织中羟脯氨酸含量显著下降，与PBS组相比，在感染后第42、56和70天的三个时间分别下降49.17%（P＜0.01）、35.36%（P＜0.01）、31.02%（P＜0.05）；（2）rAAV8-pri-miR-203组小鼠较PBS组的Ⅰ型胶原蛋白表达水平在第42天显著下降（37.71±21.55vs173.62±33.67，P＜0.01），但在第56、70天未见明显差异；（3）rAAV8-pri-miR-203组小鼠较PBS组的Ⅲ型胶原蛋白表达水平在第42天（12.35±2.97vs63.23±5.8，P＜0.01）、第56天显著下降（5.95±2.16vs20.05±8.91，P＜0.05），在第70天未见明显差异。（4）rAAV8-pri-miR-203组小鼠较PBS组的血清ALT水平在第42、56天未见明显差异，第70天显著下降（74.91±5.38vs100.75±16.70，P＜0.05）。其他检测指标各组间在3个时间点均未见明显差异。 4. miR-203在肝星状细胞中的表达变化：通过腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴，建立了血吸虫病肝纤维化小鼠模型，并在感染后第10、26、35、42和56天，用原位消化和密度梯度离心法分离和纯化肝脏中的HSC。每个时间点分离感染组和未感染组各3~5只小鼠的HSC，抽提总RNA，逆转录为cDNA，用real-time PCR方法检测各个时间点HSC miR-203的表达水平。结果显示，多次分离的HSC镜检观察纯度在95%~98%之间。正常小鼠肝星状细胞的得率可达到2×106个/鼠左右，血吸虫感染小鼠肝星状细胞的得率可达到3.6~4.8×106个/鼠左右。在血吸虫感染后第42、56天，miR-203的表达维持在较低的水平，较未感染组分别下降6.25和3.45倍。鉴于HSC是纤维化时肝组织中沉积的胶原蛋白的主要来源，我们的结果提示miR-203可能参与了血吸虫病肝纤维化过程中HSC激活的调控过程。本研究为进一步探索miR-203抑制血吸病肝纤维化的分子机制奠定了基础。 5.统计学处理实验数据采用SPSS16.0统计软件进行分析，结果以均数±标准差(x±SD)表示，两组资料的比较采用两独立样本的t检验，多组资料的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)和LSD-t检验；生存分析采用Log-rank检验。P＜0.05为差异有显著性。小结：本实验室前期研究结果表明，感染日本血吸虫小鼠肝脏的miR-203呈显著下调。本课题通过构建表达pri-miR-203的重组腺相关病毒载体（rAAV8-pri-miR-203），特异性上调感染小鼠肝脏miR-203的表达，并观察干预后小鼠在血吸虫病肝纤维化过程的变化，以探讨miR-203在血吸虫病肝纤维化中的功能。本课题采用腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴方法，建立了血吸虫病肝纤维化小鼠模型。本课题研究结果显示：（1）通过注射rAAV8-pri-miR-203病毒载体以上调肝组织中miR-203的表达，能显著延长血吸虫病小鼠的生存时间；（2）在血吸虫感染后第10天尾静脉注射5×109rAAV8-pri-miR-203病毒载体，能有效提高肝脏中miR-203的表达水平，但这种上调表达水平随着时间延长呈下降趋势；（3）上调肝组织中miR-203使感染小鼠肝组织中羟脯氨酸含量及胶原蛋白表达水平呈明显下降，这提示上调肝组织中miR-203可减轻感染小鼠的肝纤维化程度；（4）分离了日本血吸虫感染小鼠及正常小鼠不同时间点的肝脏HSC，并检测miR-203在这些细胞中的表达水平，结果显示，感染血吸虫小鼠肝脏HSC的miR-203表达水平显著下降，这提示miR-203可能参与了血吸虫病肝纤维化过程中HSC增殖及凋亡的调控过程。本研究结果表明了宿主miR-203在血吸病肝纤维化过程中发挥重要调控作用，为探索miRNA介导的血吸虫病肝纤维化治疗提供新的视角。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R532.21

【参考文献】