HBV感染者宿主细胞α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达上调及其影响的实验研究

发布时间：2019-06-04 21:41

【摘要】：研究背景据报道全球约20亿人有既往或现症乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的血清学证据,其中2.4亿人为慢性HBV感染者。慢性HBV感染往往会进展为终末期肝病、肝硬化以及原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),年死亡人数可达65万人。HBV感染持续存在的原因是多方面的,包括抗原加工和提呈受到抑制、免疫抑制微环境(IL-10,TGF-p).CD4 T细胞反应低下、细胞因子分泌抑制、负性调控(PD-1/CTLA-4/Tim-3)、T细胞和B细胞抗原表位逃逸突变、免疫细胞缺失或耗竭(由于高病毒载体或负性调节)等。其中,树突状细胞(dendritic cells,DCs)提呈HBV抗原功能缺陷和共刺激分子表达低下,是造成HBV感染持续存在的一个重要原因。作为一种Ⅱ型跨膜蛋白,DC-SIGN(DC-specific ICAM-3 grabbing non-integrin)是含有外源性甘露糖结合位点的C型凝集素(C-type lectin,CLR)结构域。其主要表达于淋巴组织成熟DCs与外周组织未成熟IDCs表面,在DCs识别病原体相关分子模式、激活初始T细胞及启动免疫应答,以及病原体的免疫逃逸中发挥重要作用。有研究显示DC-SIGN可以识别多种含有高甘露糖寡糖的病毒(例如丙型肝炎病毒,人类免疫缺陷病毒和埃博拉病毒)。HBV是一种DNA病毒,它的包膜蛋白包括大表面抗原、中表面抗原和小表面抗原,均含有丰富的甘露糖寡糖,因此DC-SIGN很可能参与对HBV的识别。N-糖基化是蛋白质翻译后的一种重要修饰,α-甘露糖苷酶Ⅰ特异性地作用于甘露糖a-1,2糖苷键,可以剪切N-寡糖中的甘露糖残基,使糖蛋白发生去甘露聚糖修饰,由高甘露糖型变为杂合型或复杂型。而M. L. Op den Brouw等人的研究揭示了HBV在一定情况下可以被DC-SIGN识别：尽管天然HBV不能与DC-SIGN结合,但用α-甘露糖苷酶Ⅰ抑制剂基夫碱处理产HBV颗粒和乙肝表面抗原的HepG2.2.15细胞,由此产生的高甘露糖HBV和乙肝表面抗原则可被DC-SIGN识别。我们之前体外研究的结果显示,与Hep G2细胞相比,Hep G2.2.15细胞MAN1A1、MAN1A2的表达明显上调。尽管HBV DNA在外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的存在形式、传染性和致病性存在争议,但PBMC无疑是HBV肝外感染的重要靶器官。本研究首先通过收集处于不同临床病程的HBV感染者的外周血,比较和分析不同临床病程α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达水平,及其与临床病程、细胞免疫应答之间的关系。另外通过构建a-甘露糖苷酶Ⅰ亚型MAN1A1的过表达和干扰重组腺病毒载体,观察MAN1A1的表达水平与乙肝表面抗原甘露糖修饰之间的关系,初步探讨a-甘露糖苷酶Ⅰ表达水平对HBV感染的影响。研究目的在前期研究工作基础上,比较和分析α-甘露糖苷酶Ⅰ在不同临床病程HBV感染中的表达水平,并初步探讨α-甘露糖苷酶Ⅰ表达水平对HBV感染的影响。实验方法1.收集90名HBV感染者和30名健康对照者的外周血,其中HBV感染者根据临床病程分为免疫耐受组、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)组、非活动性HBsAg携带组；2.Western Blot法检测a-甘露糖苷酶Ⅰ三个亚型MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1蛋白的表达水平,ELISA法检测血清白介素-12(interleukin 12, IL-12)和丫-干扰素(IFN-γ)水平以及乙肝血清学标志物,RT-PCR方法检测HBV DNA;3.使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,比较和分析a-甘露糖苷酶Ⅰ在不同阶段HBV感染中的表达水平,及其与IL-12、IFN-γ、HBV DNA的关系：4.根据Genebank中查询获得的人MAN1A1基因设计并合成特异的shRNA序列,然后通过分子克隆的方法构建MAN1A1的干扰穿梭载体pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA,酶切和测序鉴定：5.根据Genebank查询获取MAN1A1基因的编码序列,人工合成含有目的基因片段的质粒pUC57-MAN1A1,将其与pYr-adshuttle-4穿梭质粒连接,构建MAN1A1基因的过表达穿梭载体pYr-MAN1A1,酶切和测序鉴定；6.将上述干扰载体pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA和过表达载体pYr-MAN1A1通过LR体外同源重组分别与pAd/PL-DEST腺病毒骨架质粒构建重组腺病毒载体pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1,酶切和测序鉴定正确后转染至HEK 293细胞进行病毒的包装和扩增,获得MAN1A1干扰和过表达重组腺病毒。7.分别将MAN1A1干扰和过表达重组腺病毒感染HepG2.2.15细胞细胞,同时设置对应的对照组和基夫碱处理组。感染48h后用Western Blot和RT-PCR法检测各处理组MAN1A1基因和蛋白的表达水平,并收集不同处理组的上清,植物凝集素ELISA检测乙肝表面抗原的甘露糖修饰程度。实验结果1.收集到了三个组(免疫耐受组、慢性乙型肝炎组、非活动性HBsAg携带组)共90名HBV感染者和30名健康对照者的外周血,并完成各项指标的检测；2.和健康对照组相比,三个HBV感染者组MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1的表达均出现明显的上调,其中免疫耐受组的患者上调幅度最大(分别为0.66±0.19、0.66±0.18和0.56±0.15,p0.05), CHB组次之。三个HBV感染者组IL-12和IFN-γ水平显著高于健康对照组(p0.05),其中以CHB组最高(IL-12:59.08±13.38 pg/ml, IFN-γ:43.66±12.50pg/ml,p0.05),其次为免疫耐受组：3.对于处于免疫耐受期的患者,MAN1A1、MAN1A2均与HBeAg滴度和HBV DNA水平呈线性正相关,而MAN1C1仅与HBeAg滴度相关。CHB组的相关性分析显示,MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1的表达与ALT无相关性(p0.05),而与HBeAg和HBV DNA均呈正相关(r0.05,p0.01)；4.构建了针对MAN1A1的干扰穿梭载体pBSilence 1.1-MAN 1A1-shRNA和过表达穿梭载体pYr-MAN1A1,酶切和测序结果显示构建成功；5.重组腺病毒载体pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1构建成功,酶切和测序鉴定正确,并通过HEK 293细胞包装和扩增成功获得了足够的重组腺病毒：6.重组腺病毒pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1感染HepG2.2.15细胞后,MAN1A1基因的表达水平分别出现下降和上调,同时植物凝集素ELISA检测发现HepG2.2.15上清中HBsAg分别出现高甘露糖和去甘露糖修饰。结论1.不同临床阶段慢性HBV感染者的PBMC普遍存在α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达上调,这种上调在免疫耐受期的患者最高。而且,免疫耐受组和CHB组α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达水平与HBeAg滴度和HBVDNA水平均呈正相关。这些结果说明PBMC中α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达上调可能在HBV的免疫逃逸中发挥重要作用,而且表达水平与病毒复制的活跃程度密切相关：2.干扰和过表达α-甘露糖苷酶Ⅰ亚型MAN1A1的表达,可导致宿主细胞分泌HBsAg的甘露聚糖修饰发生变化,这进一步证实HBV可能通过影响宿主细胞a-甘露糖苷酶Ⅰ的表达,使乙肝表面抗原发生去甘露聚糖修饰,进而逃逸DC-SIGN的免疫识别。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62

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