HIV-1编码的microRNA-TAR和IncRNA MALAT1在HIV-1感染巨噬细胞中的作用研究
发布时间：2019-07-24 06:39
【摘要】：目的： (1)当前有很多研究报道显示病毒编码的miRNAs在病毒复制以及病毒与宿主之间的相互作用中发挥着重要作用。然而关于来源于HIV-1的TAR元件的miR-TAR-3p是否表达及其在病毒复制中的功能研究却很少有文章报道。由此,本文试图研究HIV-1编码的miR-TAR-3p在HIV-1感染的人外周血单核细胞衍生的巨噬细胞(Monocyte-derived macrophages, MDM)中的表达及其在HIV-1复制中的作用。(2) MALAT1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript)是肿瘤中一种常见长链非编码RNA,很少有文献报道MALAT1在外周血分离的MDM中的研究,我们试图利用蛋白质组学研究MDM中的长链非编码RNAMALAT1的功能以及分子机制,而MDM又是HIV-1的靶细胞,我们试图研究MALAT1在HIV-1感染的MDM中的作用。方法：(1)首先利用RT-qPCR检测miR-TAR-3p在HIV-1感染的患者外周血以及MDM中的表达；然后利用合成的miR-TAR-3p mimics和miRNA inhibitor转染进MDM后检测gag基因和p24蛋白的表达;并利用荧光素酶报告基因检测miR-TAR-3p对HIV-1转录的影响；之后再用细胞因子芯片检测miR-TAR-3p对巨噬细胞中细胞因子的影响；最后利用荧光素酶报告基因试验检测HIV-1编码的其他miRNAs对HIV-1转录的影响。 (2)首先利用RT-qPCR证实MALAT1在MDM中的表达；接着利用蛋白质组学检测MDM中MALAT1调控的所有蛋白表达以及相关功能情况；然后利用RT-qPCR检测HIV-1感染之后长链非编码RNA MALAT1和抗病毒miR-125b的表达量变化；最后转染MALAT1 siRNA之后,检测MDM中MALAT1和抗HIV-1感染的miR-125b的表达情况。结果： (1)我们检测到HIV-1感染病人外周血中以及细胞模型中有miR-TAR-3p的表达。合成的miR-TAR-3p mimics明显抑制HIV-1在巨噬细胞中的复制,合成的miR-TAR-3p Inhibitor mimics明显促进了HIV-1在巨噬细胞中的复制。双荧光素酶报告基因实验显示miR-TAR-3p通过结合5'LTR的TAR元件来抑制HIV-1的转录。利用细胞因子芯片技术来筛选有表达变化的细胞因子时,没有发现有明显变化的细胞因子。HIV-1编码的miR-N367以及miR-TAR-3p可以抑制HIV-1基因组的转录,而miR-H1对HIV-I基因组的转录没有影响。(2)RT-qPCR结果显示长链非编码RNA MALAT1在MDM中有表达。利用蛋白质组学研究MALAT1调控的蛋白,总共鉴定到4709个蛋白,包括26个上调的差异蛋白和51个下调的差异蛋白,其中STAT1的表达量明显下调,GO功能注释显示和signaling, viral reproduction相关。HIV-1感染的MDM中MALAT1表达量上升,而miR-125b表达量下降。干扰MALAT1表达的MDM中,STAT1表达量下降,miR-125b表达量上升。结论：(1)我们的研究揭示了HIV-1编码的miR-TAR-3p存在于HIV-1感染的病人外周血以及巨噬细胞中,功能研究显示miR-TAR-3p可能作为负调控因子调控HIV-1的复制。 (2)我们的研究发现MALAT1在巨噬细胞中可能发挥着重要的抗病毒免疫作用,也发现MALAT1在HIV-1感染中可能扮演重要角色。这可能对于后期利用MALAT1作为一个HIV-1潜在的治疗靶点提供理论基础。
【图文】：
从外周血分离出ＰＢＭＣ之后，利用ＧＭ－ＣＳＦ刺激单核细胞Ｍｏｎｏｃｙｔｅ分化到逡逑巨枿细胞ＭＤＭ，培养５－７ｄ之后，利用流式细胞术ＦＡＣＳ检测ＭＤＭ的阳性纯化逡逑率，结果如图１Ａ所示，超过９９％的细胞都是ＭＤＭ阳性细胞。分离得到ＭＤＭ逡逑之后，利用ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染ＭＤＭ，结果如图１Ｂ所示，随着感染天数的延长，逡逑ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染的巨嗤细胞ｐ２４蛋白表达量也逐渐上升，到感染第１５ｄ的时逡逑候，ｐ２４蛋白的表达量己经到？６０ｐｇ／ｍｌ。与此同时，我们观察到ＨＩＶ－１感染的巨逡逑枿细胞中有合胞体的形成，而且随着感染天数的延长，合胞体越来崣多。逡逑为了进一步确认ＨＩＶ－１感染的巨枿细胞会诱导合胞体的形成，在ＨＩＶ－１感染逡逑第９ｄ的时候，利用Ｈｏ浊ｅｓｔ染色的试验方法，发现在ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ感染的巨幢细胞逡逑中，观察到有合胞体的形成。在未感染的正常对照巨枿细胞中
第９ｄ的时候，利用Ｈｏ浊ｅｓｔ染色的试验方法，发现在ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ感染的巨幢细胞逡逑中，观察到有合胞体的形成。在未感染的正常对照巨枿细胞中，没有观察到合胞逡逑体的形成（如图２Ａ所示）。为了进一步确认该结果，通过换用不同的视野观察，逡逑在（Ｘ２００）邋（Ｘ４００）倍巧光显微镜下分别观察照相，均看到合胞体的形成（如图逡逑２Ｂ所示）。逡逑这些实验结果说明我们成功建立了邋ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染人外周血单核细胞衍逡逑生巨幢细胞ＭＤＭ的模型。逡逑３N２邋ＨＩＶ－１邋ＮＬ４－３毒株感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ细胞模型的建立逡逑从人外周血分离到ＰＢＭＣ之后，我们试图建立ＨＩＶ－１感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ逡逑细胞的模型。由于ＣＤ４＋Ｔ细胞与ＭＤＭ的受体不同，需要利用能够感染Ｔ细胞逡逑的ＨＩＶ－１毒株ＮＬ４－３。因此，要建立此模型，首先将ＰＮＬ４－３质粒转染至２９３Ｔ逡逑细胞。然后收集上清ＨＩＶ－１邋ＮＬ４－３毒株感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ细胞。如图３Ａ所逡逑示，感染第０天，无ＨＩＶ－１感染时，ＨＩＶ－１邋ｇａｇ基因的表达量为０，随着感染天逡逑数的X椉樱龋桑郑钡模纾幔缁虻谋泶锪恐鸾ピ黾印＝酉吕矗掷茫牛蹋桑樱良觳忮义锨郑卞澹危蹋矗冲澹穑玻吹鞍椎谋泶锼剑缤迹常滤荆蓿龋桑郑备腥臼保龋桑郑卞澹穑玻村义系鞍椎谋泶锪课
本文编号：2518461
【图文】：
从外周血分离出ＰＢＭＣ之后，利用ＧＭ－ＣＳＦ刺激单核细胞Ｍｏｎｏｃｙｔｅ分化到逡逑巨枿细胞ＭＤＭ，培养５－７ｄ之后，利用流式细胞术ＦＡＣＳ检测ＭＤＭ的阳性纯化逡逑率，结果如图１Ａ所示，超过９９％的细胞都是ＭＤＭ阳性细胞。分离得到ＭＤＭ逡逑之后，利用ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染ＭＤＭ，结果如图１Ｂ所示，随着感染天数的延长，逡逑ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染的巨嗤细胞ｐ２４蛋白表达量也逐渐上升，到感染第１５ｄ的时逡逑候，ｐ２４蛋白的表达量己经到？６０ｐｇ／ｍｌ。与此同时，我们观察到ＨＩＶ－１感染的巨逡逑枿细胞中有合胞体的形成，而且随着感染天数的延长，合胞体越来崣多。逡逑为了进一步确认ＨＩＶ－１感染的巨枿细胞会诱导合胞体的形成，在ＨＩＶ－１感染逡逑第９ｄ的时候，利用Ｈｏ浊ｅｓｔ染色的试验方法，发现在ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ感染的巨幢细胞逡逑中，观察到有合胞体的形成。在未感染的正常对照巨枿细胞中
第９ｄ的时候，利用Ｈｏ浊ｅｓｔ染色的试验方法，发现在ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ感染的巨幢细胞逡逑中，观察到有合胞体的形成。在未感染的正常对照巨枿细胞中，没有观察到合胞逡逑体的形成（如图２Ａ所示）。为了进一步确认该结果，通过换用不同的视野观察，逡逑在（Ｘ２００）邋（Ｘ４００）倍巧光显微镜下分别观察照相，均看到合胞体的形成（如图逡逑２Ｂ所示）。逡逑这些实验结果说明我们成功建立了邋ＨＩＶ－１邋Ｂａｌ毒株感染人外周血单核细胞衍逡逑生巨幢细胞ＭＤＭ的模型。逡逑３N２邋ＨＩＶ－１邋ＮＬ４－３毒株感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ细胞模型的建立逡逑从人外周血分离到ＰＢＭＣ之后，我们试图建立ＨＩＶ－１感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ逡逑细胞的模型。由于ＣＤ４＋Ｔ细胞与ＭＤＭ的受体不同，需要利用能够感染Ｔ细胞逡逑的ＨＩＶ－１毒株ＮＬ４－３。因此，要建立此模型，首先将ＰＮＬ４－３质粒转染至２９３Ｔ逡逑细胞。然后收集上清ＨＩＶ－１邋ＮＬ４－３毒株感染人的原代ＣＤ４＋Ｔ细胞。如图３Ａ所逡逑示，感染第０天，无ＨＩＶ－１感染时，ＨＩＶ－１邋ｇａｇ基因的表达量为０，随着感染天逡逑数的X椉樱龋桑郑钡模纾幔缁虻谋泶锪恐鸾ピ黾印＝酉吕矗掷茫牛蹋桑樱良觳忮义锨郑卞澹危蹋矗冲澹穑玻吹鞍椎谋泶锼剑缤迹常滤荆蓿龋桑郑备腥臼保龋桑郑卞澹穑玻村义系鞍椎谋泶锪课
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