核酸序列依赖扩增联合酶联免疫试验检测侵袭性曲霉菌的实验研究

发布时间：2019-08-15 09:13

【摘要】：目的侵袭性曲霉菌感染(invasive aspergillosis,IA)严重的威胁着免疫力低下病人的生命,早期准确的诊断与治疗是良好预后的关键。本研究拟建立核酸序列依赖扩增联合酶联免疫吸附试验(NASBA-ELISA)检测曲霉菌的方法,并结合GM试验和逆转录PCR(RT-PCR)辅助诊断侵袭性曲霉病,为其提供的最佳实验室诊断策略。方法将NASBA方法和高灵敏度的地高辛检测系统相结合,以链酶亲和素包被的微孔板为反应平台,采用地高辛标记NASBA恒温扩增曲霉菌特异性18sRNA基因片段;并用生物素标记的DNA探针杂交捕获地高辛标记的NASBA扩增产物,然后加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体和底物进行酶标显色,并对其灵敏度、特异度进行评价。最后进行临床验证:收集86例IA高危患者的血清标本,分别用NASBA-ELISA、RT-PCR和GM试验对其进行检测,比较这3种方法的性能指标,并对各种可能的联合诊断方案进行比较分析,拟找到一种最佳的IA实验室诊断方案。结果成功建立NASBA-ELISA检测曲霉菌的方法,其灵敏度可达1 Cfu,特异性良好;ELISA的光密度值(OD)与霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=0.278x+0.119,R2=0.887)。NASBA-ELISA、GM及RT-PCR试验方法的灵敏度分别为80.56%、58.33%、72.22%,特异度分别为80.00%、82.00%、84.00%。在联合诊断时,NASBA-ELISA与RT-PCR串联方案具有最完美的特异度(100%)和阳性预测值(100%);NASBA-ELISA和RT-PCR并联方案则有最好的灵敏度(94.12%)与尤登指数(0.652)。结论NASBA-ELISA方法可半定量检测曲霉菌,具有敏感性高、特异性强、操作简便的特点,适合常规实验室开展,为侵袭性曲霉病的早期诊断提供了一条新方法。同时与其他检测方法进行联合的诊断方案能够显著优化诊断效能,进一步提高临床早期诊断侵袭性曲霉病的准确性。
【图文】：

图 1.1 电泳检测 NASBA 扩增产物的灵敏度Fig 1.1 Analytical sensitivity of NASBA followed by 1% agarose gelelectrophoresis with Goldview for 10-fold serial dilutions of genomicRNA extracted from a saline solution containing 105 CFU注：M 为 Marker；1-7 分别为 NASBA 检测 105CFU、104CFU、103CFU、102C1 CFU、0.1 CFU；8 为阴性对照。3.2 NASBA 结合 ELISA 检测曲霉菌灵敏度评价NASBA 扩增梯度稀释的曲霉孢子提取的 RNA，经 ELISA 方法检图 1.2，表明本方法灵敏度可达 1 个孢子，且 OD 值与曲霉菌孢子量的性相关关系见图 1.3；NASBA 扩增曲霉菌后连续等倍稀释，再经 ELIS果见图 1.4，可见吸光度值与所测 RNA 的浓度变化成正相关。

图 1.2 NASBA-ELISA 方法检测曲霉菌的灵敏度评价 Sensitivity of the NASBA-ELISA for molecular detection of Aspergillus 180.0870.1320.3020.4330.6751.3461.7450.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0OD:405nmspores concentration10-1100101102103
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R519

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本文编号：2526903