慢病毒介导的弓形虫gra15_Ⅱ减轻日本血吸虫病小鼠肝纤维化机制的研究

发布时间：2020-04-08 07:24

【摘要】：背景:不同病因引起的肝脏慢性炎症都会引起纤维化的免疫反应,最终会导致肝衰竭。目前,基因治疗是一种很有前景的治疗方法,通过激活巨噬细胞减轻肝纤维化。GRA15_(II)可以直接诱导巨噬细胞激活为M1型巨噬细胞。我们前期的研究表明,LV-gra15_Ⅱ可体外驱使巨噬细胞向M1型巨噬细胞偏移,尾静脉注射激活的M1型巨噬细胞进入日本血吸虫病小鼠模型体内可以明显改善血吸虫病肝纤维化程度。目的:我们的研究目的是为了确定LV-gra15_Ⅱ能否在体内促使肝巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞(LV-gra15_Ⅱ-M),并探索激活的LV-gra15_Ⅱ-M减轻血吸虫病肝纤维化的潜在机制。方法:首先,从Ⅱ型弓形虫PRU株扩增出LV-gra15_Ⅱ基因,构建重组的pEGFP-gra15_Ⅱ质粒,然后,LV-gra15_Ⅱ由吉凯公司构建。最后,分别通过尾静脉高压注射将LV-gra15_Ⅱ,LV-blank或PBS进SPF级的BALB/c小鼠体内,七天后,经皮肤感染日本血吸虫尾蚴15±2条制作肝纤维化小鼠模型,并在感染当天分别再进行一次尾静脉注射LV-gra15_Ⅱ,LV-blank或PBS,尾蚴感染8周后,麻醉小鼠留取血液,提取肝组织及肝巨噬细胞检测肝功能,纤维化相关指标及肝巨噬细胞激活状态,然后将肝巨噬细胞与小鼠肝星状细胞株(JS1)体外进行共培养,观察JS1细胞凋亡情况及MMP13溶解胶原的情况。结果:结果发现LV-gra15_Ⅱ不仅成功地进入了小鼠肝巨噬细胞,而且能够有效且持续地在肝巨噬细胞内表达GRA15_Ⅱ蛋白至少2个月以上。此外,LV-gra15_Ⅱ诱导的LV-gra15_Ⅱ-M在体内表现为M1型巨噬细胞,伴iNOS,TNF-α和Ly6C表达的增加,及CD206表达的降低。LV-gra15_Ⅱ的注射能明显降低日本血吸虫病小鼠肝肉芽肿和纤维化,伴TGF-β1,Arg-1,α-SMA表达明显降低,及MMP13表达明显增高,而肝功能和小鼠的活力并没有受到影响。体外实验表明,LV-gra15_Ⅱ-Ms的细胞上清中趋化因子配体2(CCL2)和一氧化氮(NO)水平明显升高。此外,在transwell系统中,LV-gra15_Ⅱ-Ms不仅能够分泌溶解Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)的MMP13,而且还能促进JS1细胞凋亡。结论:总之,我们研究发现LV-gra15_Ⅱ通过尾静脉注射后可使小鼠肝脏巨噬细胞激活为M1型巨噬细胞,并在肝组织中诱发Th1/M1偏移的免疫反应;而Th1/M1型为主的免疫微环境能够通过减少TGF-β1的分泌,增加MMP13的表达和促进肝星状细胞细胞的凋亡减轻血吸虫病肝纤维化。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R532.21;R575.2

【参考文献】