宿主细胞Kv1.3钾通道抗病毒功能的发现与作用机制研究

发布时间：2020-04-13 20:34

【摘要】：病毒感染会导致严重危害人类健康的疾病,常常引起全球的关注、担忧甚至恐慌。例如美洲出现了寨卡病毒(ZIKV)的爆发流行,其感染导致小头畸形症和格林-巴利综合征。登革热病毒(DENV)每年大约造成3.9亿人口感染,导致登革热、登革出血热以及登革休克综合症等。丙型肝炎病毒(HCV)感染导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌,全球大约有1.7亿人感染。病毒作为绝对的细胞内寄生生物,必须进入宿主细胞才能启动复制、传播和维持病毒感染。因此干扰病毒进入宿主细胞途径阻止病毒感染,是一种高效、优良的抗病毒策略。为了进入宿主细胞,大多数病毒利用细胞的内吞机器。病毒在细胞质膜、内吞体、内质网和核膜等位置通过膜融合或侵入将病毒核酸释放到细胞内,该融合或侵入过程通常与pH值相关,而调节细胞和细胞器的pH值是离子通道的生理功能。显然,离子通道在病毒进入宿主细胞过程应该扮演了十分重要的角色。但是宿主离子通道和病毒感染之间的关系很少被探究。离子通道是细胞质膜或者细胞器膜内外物质进行离子交换的膜通道蛋白,对维持细胞的各种生理功能具有重要作用。Kv1.3钾通道广泛地分布在兴奋与非兴奋细胞的细胞质膜和细胞器膜表面,介导细胞质膜K+外流、细胞器膜K+内流,对于维持静息膜电位、调节膜的复极化、细胞增殖、细胞凋亡和细胞体积等至关重要。Kv1.3钾通道异常表达与胰岛素抗性、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、癌症等密切相关,因此Kv1.3钾通道被作为多种疾病治疗与诊断的靶标。然而Kv1.3钾通道和病毒感染之间的关系并不清楚。首先,本研究分析了马氏正钳蝎防御素BmKDfsin3的基因表达与功能。采用蝎子细菌感染模型、启动子克隆与活性研究等,揭示了马氏正钳蝎防御素BmKDfsin3为组成型转录表达模式。在HCV Huh7.5.1细胞感染体系中,BmKDfsin3能够浓度依赖地抑制HCV复制,其IC50为2.34 μM。与此同时,BmKDfsin3还具有Kv1.3钾通道活性选择性抑制功能,其IC50为23.4nM。过去我们课题组曾经发现Kv1.3钾通道选择性蝎毒素多肽抑制剂BmKTX-D33H和ADWX-1阻断Kv1.3钾通道活性的IC50分别为15.4pM和1.89pM,本研究发现它们也可以有效抑制HCV复制,其抑制HCV复制的IC50分别为1.22 μM和24.20 nM。研究暗示,Kv1.3钾通道选择性蝎毒素多肽抑制剂影响HCV复制可能具有普遍性,并且其抑制HCV复制功能与抑制Kv1.3通道活性功能呈正相关。这些实验结果显示,以马氏正钳蝎防御素BmKDfsin3为分子探针发现的Kv1.3钾通道可能影响HCV复制。其次,研究了 Kv1.3钾通道在HCV感染的人肝细胞系Huh7.5.1和肝组织中的表达与活性。RT-PCR、Western blot和免疫组化分析等揭示,在mRNA和蛋白质水平上,人肝细胞系Huh7.5.1和肝脏组织均有Kv1.3钾通道表达。采用全细胞膜片钳技术,在Huh7.5.1细胞膜表面也能够检测到Kv1.3钾通道电流。研究还发现,HCV复制以不依赖于干扰素的方式上调Huh7.5.1细胞系中Kv1.3钾通道的mRNA和蛋白含量,而且免疫组化分析显示,HCV感染患者的肝组织中Kv1.3蛋白表达也升高了。同时,在构建的Kv1.3钾通道稳定过表达的Huh7.5.1细胞系Kv1.3-stable中,HCV复制不仅上调Kv1.3钾通道的mRNA和蛋白含量,而且也增强其细胞膜表面Kv1.3钾通道电流。这些实验结果发现了 HCV复制能够上调Kv1.3钾通道的表达并增强宿主细胞膜Kv1.3钾通道电流,暗示了宿主细胞Kv1.3钾通道与HCV复制有十分紧密的联系。然后,开展了 Kv1.3钾通道对HCV复制影响的研究。采用分子克隆、细胞转染、qRT-PCR和Western blot等技术在Huh7.5.1细胞中过表达Kv1.3钾通道,实验结果显示,该通道的过表达会抑制HCV复制。同时,将过表达的Kv1.3钾通道下调可以回复其对HCV复制的抑制作用。并且,Kv1.3钾通道基因的敲除促进HCV复制。这些实验结果显示了宿主细胞Kv1.3钾通道能够有效地抑制HCV的复制。Kv1.3钾通道抑制HCV复制的作用阶段实验表明:Kv1.3钾通道抑制HCV进入宿主细胞过程,不影响HCV病毒颗粒的完整性和感染性,不作用于HCV进入宿主细胞的吸附阶段,而作用于HCV进入细胞过程的吸附后阶段。利用电子透射显微镜技术观察到Kv1.3钾通道能够将HCV颗粒阻滞在囊泡中。因此,这些研究表明,宿主细胞Kv1.3钾通道能够抑制HCV进入宿主细胞,且密切相关于病毒包膜与内吞体膜融合阶段。接着,本研究阐明了 Kv1.3钾通道抑制HCV进入宿主细胞的作用机制。在Huh7.5.1细胞中,Kv1.3钾通道定位于早期内吞体、晚期内吞体、溶酶体等酸性细胞器上,且与HCV进入宿主细胞过程存在共定位。过表达Kv1.3钾通道导致酸性细胞器pH升高。细胞与细胞膜融合研究发现,Kv1.3钾通道可以抑制HCV E1E2包膜蛋白介导的膜融合过程,而且过表达Kv1.3钾通道可以放大酸性细胞器抑制细胞器膜融合。这些实验结果表明,宿主细胞Kv1.3钾通道通过抑制内吞体酸化过程影响HCV包膜与内吞体膜的融合,从而阻止HCV的RNA基因组释放到细胞质,最终限制HCV进入宿主细胞。最后,研究了 Kv1.3钾通道限制病毒进入宿主细胞的广谱性。黄病毒科包膜病毒DENV和ZIKV具有与HCV类似的入胞过程,均经由内吞体酸化介导的膜融合过程进入宿主细胞。qRT-PCR、Western blot、噬斑实验、透射电镜和膜融合等实验结果显示,宿主细胞Kv1.3钾通道同样可以影响病毒包膜与宿主细胞内吞体膜的融合,从而有效抑制DENV和ZIKV的复制。与HCV、DENV和ZIKV不同,副粘液病毒科的包膜病毒SeV进入细胞的膜融合过程是在中性pH条件和细胞质膜表面发生。病毒RNA检测实验结果显示,过表达Kv1.3钾通道并不影响SeV复制。因此,Kv1.3钾通道是一个广谱的限制病毒进入宿主细胞的抗病毒蛋白,抑制经由内吞体酸化介导的膜融合过程进入宿主细胞的一类病毒的复制。综上所述,本研究首先以马氏正钳蝎防御素BmKDfsin3为分子探针,发现了宿主细胞Kv1.3钾通道影响HCV复制的可能。然后,揭示了宿主细胞Kv1.3钾通道具有抑制HCV入胞过程膜融合作用的功能,阐明了宿主细胞Kv1.3钾通道通过影响内吞体酸化抑制膜融合过程的抗HCV感染机制,并证明了 Kv1.3钾通道是一个广谱的限制病毒进入宿主细胞的抗病毒蛋白。本研究首次发现了Kv1.3钾通道抑制病毒进入宿主细胞过程膜融合阶段的新功能,为防治HCV、DENV和ZIKV等黄病毒甚至其它病毒感染提供了新的策略与途径,也为宿主细胞离子通道作为广谱抗病毒靶标提供了理论基础。
【图文】：

马氏,抑制活性,通道,半数抑制浓度

基于非脊椎动物ＣＳａ（３防御素与ａ－ＫＴｘ具有相似的空间结构，孟兰霞（２０１７）逡逑利用ＮＭＲ技术对与ａ－ＫＴｘ氨基酸性质最为接近的ＢｍＫＤｆｓｉｎ３进行了结构解析逡逑（图１．１），并研究了邋ＢｍＫＤｆｓｉｎ３，邋４和５对不同钾通道活性的抑制功能。最终发逡逑现ＢｍＫＤｆｓｉｎ３能够明显抑制钾通道Ｋｖｌ．ｌ、Ｋｖｌ．２、Ｋｖｌ．３和ＳＫ３通道活性，其逡逑中对Ｋｖｌ．３通道抑制活性最好，半数抑制浓度为２３．４邋士邋５．０邋ｎＭ；邋ＢｍＫＤｆｓｉｎ４对逡逑Ｋｖｌ．ｌ、Ｋｖｌ．２和Ｋｖｌ．３通道具有明显抑制活性，对Ｋｖｌ．３通道抑制活性也最好，逡逑半数抑制浓度为５１０．２±邋１６１．２ｎＭ；邋ＢｍＫＤｆｓｉｎ５只能抑制ＳＫ３活性。通道突变体逡逑研究发现，ＢｍＫＤｆｓｉｎ３作用于Ｋｖｌ．３通道的孔区Ｓ５－Ｓ６邋ｌｉｎｋｅｒ。这是蝎防御素抑逡逑制离子通道活性功能的首次发现，并且发现了马氏正钳蝎防御素ＢｍＫＤｆｓｉｎ３作逡逑６逡逑

电压门控,离子通道,通道,钾通道

离子通道的开放和关闭称为门控。门控性和离子选择性是离子通道的两大属性。逡逑根据门控特性可将离子通道分为电压门控离子通道、配体门控离子通道和其逡逑它类型离子通道。电压门控离子通道的分类如图１．２所示，，包括钾通道、电压门逡逑控钠通道（ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ邋ｓｏｄｉｕｍ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｎａｖ）、电压门控钥通道（ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ逡逑ｃａｌｃｉｕｍ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ，ＶＧＣＣ邋或邋Ｃａｖ）、瞬时受体势通道（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋ｐｏｔｅｎｔｉａｌ逡逑ｃｈａｎｎｅｌｓ，邋ＴＲＰ）、ＣａｔＳｐｅｒ和双孔通道（ＣａｔＳｐｅｒａｎｄＴＰＣｓ）、电压门控质子通道、逡逑阿诺定受体和环核苷酸调节通道（ｃｙｃｌｉｃｎｕｄｅｏｔｉｄｅ－ｍｏｄｕａｔｅｄｃｈａｎｎｅｌ，ＣＮＧ）等。逡逑其中钾通道又分为电压门控钾通道（ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ邋ｐｏｔａｓｓｉｕｍ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｋｖ）、双孔逡逑钾通道（ｔｗｏｐｏｒｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｋ２ｐ）、内向修复钾通道（ｉｎｗａｒｄｌｙｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ逡逑ｐｏｔａｓｓｉｕｍ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｋｉｒ）、妈和钠激活的钾通道。配体门控离子通道包括酸敏感逡逑（质子门控）离子通道（ａｃｉｄ－ｓｅｎｓｉｎｇ邋（ｐｒｏｔｏｎ－ｇａｔｅｄ）邋ｉｏｎ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R511

【参考文献】