酒精通过PIASy诱导细胞自噬促进HCV复制的机制研究

发布时间：2020-04-16 00:10

【摘要】：目的酒精能够促进丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)在肝细胞中复制,但机制尚未完全阐明。我们前期研究发现酒精可以上调激活的STAT抑制蛋白y(protein inhibitor of activated STATy,PIASy)在肝细胞表达,本研究对其在诱导细胞自噬及对HCV复制的影响和涉及的具体机制开展研究,以期发现酒精促进HCV复制的新机制。方法本研究利用肝癌细胞系—Huh7细胞(支持HCV JFH-1复制),采用体外研究的方法开展研究。首先,用不同浓度的酒精处理HCV感染的Huh7细胞,采用实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和免疫印迹法(Western Blot,WB)分别在基因及蛋白水平检测HCV RNA和HCV core蛋白的表达水平,探讨酒精对HCV复制的影响。其次,在酒精处理的条件下,分别在m RNA及蛋白水平检测PIASy m RNA及PIASy蛋白的表达,验证酒精是否上调PIASy的表达;并在酒精处理的条件下,Huh7细胞过表达或敲降PIASy,用WB检测HCV core蛋白,分析PIASy的表达对酒精促进HCV复制的影响。再次,在酒精处理的条件下,检测LC3 m RNA水平和LC3B-I、LC3B-II、p62蛋白水平的表达,利用含GFP-LC3慢病毒转染Huh7细胞,采取免疫荧光检测GFP-LC3点状聚集,分析酒精对细胞自噬的影响,并利用自噬体-溶酶体融合抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)处理,分别用WB及免疫荧光显微镜观察LC3B-I、LC3B-II蛋白的表达和GFP-LC3点状聚集情况,分析酒精处理对细胞自噬流的影响,进一步过表达或敲降PIASy表达,检测LC3B-I、LC3B-II、p62蛋白水平的变化,分析PIASy的表达对酒精诱导细胞自噬的影响;此外,用自噬早期抑制剂3-甲基腺苷(3-methyladenine,3-MA)处理过表达或敲降PIASy表达的感染HCV的Huh7细胞,WB检测LC3B-I、LC3B-II、HCV core蛋白的表达水平,观察3-MA抑制PIASy促进自噬的作用及其对HCV复制的影响;最后,在Huh7细胞过表达或敲降PIASy表达条件下,CQ处理细胞,用WB和免疫荧光显微镜检测LC3B-I、LC3B-II蛋白水平和GFP-LC3点状聚集,观察PIASy对自噬流的影响;分别用SUMO 1及SUMO 2/3抗体及自噬相关因子抗体检测PIASy表达对蛋白SUMO化修饰和自噬相关因子表达的影响,分析PIASy诱导Huh7细胞自噬的潜在机制。结果1.酒精促进HCV在Huh7细胞中复制。用不同浓度的酒精、采用不同时间处理HCV感染的Huh7细胞,Huh7细胞中HCV RNA及HCV core蛋白表达水平显著上调,并且呈浓度及时间依赖趋势(p0.05)。表明酒精促进HCV复制。2.酒精通过上调PIASy表达促进HCV在Huh7细胞中的复制。(1)酒精上调Huh7细胞PIASy的表达用不同浓度的酒精、采用不同时间处理Huh7细胞,Huh7细胞内PIASy m RNA水平及PIASy蛋白水平的表达显著上调,并且呈浓度及时间依赖趋势(p0.05),酒精对PIAS家族其他蛋白的表达水平无显著影响(p0.05)表明酒精只特异性促进PIASy表达。(2)酒精通过上调PIASy表达促进HCV的复制。采用过表达和敲降PIASy表达研究PIASy在酒精促进HCV复制中的作用。过表达PIASy上调HCV core蛋白水平(p0.05);并且过表达PIASy显著增强酒精上调HCV core蛋白水平(p0.05)。敲降PIASy表达则显著下调HCV core蛋白水平(p0.05),同时敲降PIASy表达下调了酒精处理条件下的HCV core蛋白水平(p0.05)。3.酒精通过上调PIASy表达诱导Huh7细胞的细胞自噬(1)酒精处理诱导Huh7细胞的自噬。用不同浓度的酒精、采用不同时间处理Huh7细胞,酒精对Huh7细胞LC3 m RNA的表达水平无显著影响(p0.05),但是显著上调了LC3B-II蛋白水平,并促进LC3B-I向LC3B-II转化(LC3B-II/LC3B-I)及下调p62的蛋白水平(p0.05);同时,在免疫荧光显微镜下观察到在酒精处理条件下,围绕在细胞核周围的GFP-LC3点状聚集明显增多(p0.05)。表明酒精诱导Huh7细胞产生细胞自噬。在酒精处理的条件下,再用氯喹(Chloroquine,CQ;细胞自噬体-溶酶体融合抑制剂)处理,氯喹能上调LC3B-II水平(p0.05),在免疫荧光显微镜下观察到氯喹及酒精共处理组GFP-LC3点状聚集显著高于氯喹或酒精单独处理组(p0.05)。(2)酒精通过上调PIASy表达诱导Huh7细胞自噬在PIASy过表达条件下,PIASy过表达或酒精处理都能上调LC3B-II的蛋白表达水平、促进LC3B-I向LC3B-II转换及下调P62的表达(p0.05);过表达PIASy显著增强酒精上调LC3B-II的蛋白表达水平、促进LC3B-I向LC3B-II转换及下调P62的表达的作用。而敲降PIASy表达,细胞内的LC3BII蛋白表达水平下调、LC3B-I向LC3B-II转换水平下降,及P62的表达水平上调(p0.05);同时,酒精上调的LC3B-II的蛋白表达水平、LC3转换(LC3B-II/LC3B-I)及下调P62的表达的作用被抑制(p0.05)。4.PIASy诱导细胞自噬促进HCV的复制。在过表达或敲降PIASy表达的条件下,3-甲基腺苷(3-MA,细胞自噬早期抑制剂)能显著抑制PIASy过表达组中LC3B-II蛋白表达水平的上调、LC3B-I转换LC3B-II水平的升高,及P62蛋白表达水平的下调(p0.05),并下调HCV core蛋白的表达水平(p0.05);3-MA处理可显著增强敲降PIASy表达引起的HCV core蛋白水平下调(p0.05)。5.PIASy通过促进SUMO 1介导的蛋白修饰诱导细胞自噬(1)PIASy对细胞自噬流的影响在CQ处理的条件下,过表达PIASy进一步提高CQ诱导的LC3B-II蛋白表达水平、LC3B-I向LC3B-II转换(LC3B-II/LC3B-I)水平(p0.05)。并且,GFP-LC3点状聚集显著增多(p0.05);敲降PIASy表达,降低CQ引起的LC3B-II的蛋白堆积水平(p0.05);同时,CQ诱导的GFP-LC3点状聚集显著减少(p0.05)。(2)PIASy通过促进SUMO 1介导的蛋白修饰诱导细胞自噬。在过表达或敲降PIASy表达的条件下,分别用SUMO1和SUMO2/3抗体检测SUMO化修饰蛋白水平。过表达PIASy能显著促进SUMO1介导的SUMO化修饰蛋白水平(p0.05),对SUMO2/3介导的SUMO化蛋白修饰水平无显著影响(p0.05);敲降PIASy表达,SUMO1介导的蛋白修饰水平明显降低(p0.05),而SUMO2/3介导的SUMO化蛋白修饰水平无显著影响(p0.05)。同时,PIASy过表达上调自噬相关因子ATG5-12复合体和ATG7的表达(p0.05),敲降PIASy表达则下调了ATG5-12和ATG7表达(p0.05)。结论上述结果表明酒精通过上调PIASy的表达来诱导Huh 7细胞产生细胞自噬,进而促进HCV复制,同时,PIASy可能通过促进SUMO 1介导的SUMO化蛋白修饰诱导自噬作用。本研究为酒精促进HCV复制机制提出了一种新的解释。
【图文】：

图 1.酒精促进 HCV 复制在 Huh7 细胞中Fig 1. Alcohol enhances HCV replication in Huh7 cells(A, B) Alcohol promotes HCV replication in dose dependent manners. HCV JFH-1-infected Huh7 cells wereincubated with alcohol (0mM, 20mM, 40mM, 80mM) for 96h. (C, D) Alcohol promotes HCV replication intime dependent manners. HCV JFH-1-infected Huh7 cells were treated with alcohol (80mM) for differenttimes(0h,48h,96h,144h). (A, C)The levels of intracellular HCV RNA in alcohol-treated or untreated controlcells, with normalization to corresponding GAPDH mRNA level, are expressed as the fold of control (withoutalcohol treatment, which was defined as 1). (B, D) Representative western blot image shows HCV coreprotein expression in alcohol-treated or untreated control cells, β-actin was used as a loading control, theband intensities of HCVcore and β-actin were quantified by image J software. The relative HCVcore/β-actinratios were calculated and shown as the fold of control (without alcohol treatment, which was defined as 1).The datas shown in Fig.1 are the mean ±SD of the results of three independent experiments. The p valueswere calculated by ANOVA. (*, p<0.05, **, p<0.01).

图 1.酒精促进 HCV 复制在 Huh7 细胞中Fig 1. Alcohol enhances HCV replication in Huh7 cells) Alcohol promotes HCV replication in dose dependent manners. HCV JFH-1-infected Huh7 cellated with alcohol (0mM, 20mM, 40mM, 80mM) for 96h. (C, D) Alcohol promotes HCV replica dependent manners. HCV JFH-1-infected Huh7 cells were treated with alcohol (80mM) for dis(0h,48h,96h,144h). (A, C)The levels of intracellular HCV RNA in alcohol-treated or untreated c, with normalization to corresponding GAPDH mRNA level, are expressed as the fold of control (wol treatment, which was defined as 1). (B, D) Representative western blot image shows HCVin expression in alcohol-treated or untreated control cells, β-actin was used as a loading contr intensities of HCVcore and β-actin were quantified by image J software. The relative HCVcore/s were calculated and shown as the fold of control (without alcohol treatment, which was defineddatas shown in Fig.1 are the mean ±SD of the results of three independent experiments. The p calculated by ANOVA. (*, p<0.05, **, p<0.01).
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.63

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本文编号：2629156