卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染神经元细胞的特点分析与差异基因筛选

发布时间：2020-04-23 03:11

【摘要】：目的:检测卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus,KSHV)能否在体外感染神经元细胞SH-SY5Y,检测感染与未感染神经元细胞的增殖、迁移等特点并筛选差异表达基因。方法:(1)体外常规培养islk.219细胞,采用强力霉素与丁酸钠诱导其释放KSHV病毒于上清液中,采用病毒浓缩法提取KSHV,并用其感染神经元细胞SH-SY5Y,48h后采用荧光显微镜观察确定感染成功,并观察细胞形态变化。(2)采用实时定量PCR(real-time-PCR,RT-PCR)检测KSHV潜伏态基因潜伏相关核抗原(Latency-associated Nuclear Antigen,LANA)与裂解态基因ORF26、K8.1A、RTA的m RNA表达水平。(3)采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测了KSHV潜伏态基因LANA与裂解态基因RTA、K8.1A的表达水平。(4)采用MTT和Transwell检测KSHV对细胞增殖及迁移能力的影响,采用流式细胞技术检测感染与未感染SH-SY5Y细胞的细胞周期,采用Western Blot检测细胞周期蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1、P27的表达水平,在SH-SY5Y细胞中,转染LANA质粒后,进一步比较CDK4、CDK6、Cyclin D1、P27的表达水平。(5)利用转录组测序技术筛选KSHV感染SH-SY5Y细胞后的差异基因,采用Gene Ontology、KEGG等生物信息技术对测序结果进行了分析,并对Notch信号通路活性进行了检测。结果:(1)成功诱导islk.219细胞产生KSHV病毒,荧光显微镜观察到KSHV在体外感染神经元细胞SH-SY5Y后的绿色荧光,确定感染成功;感染后细胞形态由梭形聚团生长改变为细胞变大,形态变圆和分散生长;(2)KSHV感染SH-SY5Y细胞后潜伏态基因LANA与裂解态基因RTA、ORF26、K8.1A的m RNA及蛋白表达水平显著提高(P0.05)。(3)KSHV感染神经元细胞SH-SY5Y后,增殖能力显著提高,迁移能力减弱。细胞周期结果显示KSHV感染后能促进细胞G0/G1期进展。细胞周期蛋白Cyclin D 1、CDK 4和CDK 6的表达水平升高,P27的表达水平降低。LANA质粒转染进SH-SY5Y细胞后,Cyclin D 1、CDK 4的表达水平升高。(4)转录组测序检测到KSHV感染SH-SY5Y后,11258条基因表达上调,1967条基因表达下调,KEGG pathway提示Notch信号通路相关性较强,Western Blot检测发现KSHV感染的SH-SY5Y细胞中Notch信号通路蛋白Notch1、NICD及其下游基因RBP-JK、Hes 1的表达水平显著提高(P0.001)。结论:(1)KSHV能够在体外成功感染神经元细胞SH-SY5Y,并表达其潜伏态与裂解态相关蛋白。(2)KSHV感染神经元细胞后促进其增殖,细胞迁移能力减弱。(3)KSHV感染神经元细胞后上调了Notch信号通路相关蛋白的表达,这可能与促进细胞增殖能力相关。
【图文】：

强力霉素与丁酸钠诱导islk.219细胞后显微镜下观察细胞形态（100×）

Taq-manrealtimePCR标准曲线
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R511

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本文编号：2637289