NAs治疗后cccDNA转录活性与HBV pgRNA、DNA和HBsAg动力学关系的体外研究

发布时间：2020-05-10 11:12

【摘要】：目的探讨NAs治疗后cccDNA转录活性与HBV pgRNA、DNA和HBsAg的动力学关系,探索pgRNA作为cccDNA转录活性的新标志物的可行性。方法建立体外TDF抗病毒HepG2.2.15细胞模型,于基线、抗病毒12d、24d和36d收集细胞及上清液;提取细胞内总DNA,经PSAD消化、滚环扩增、跨缺口实时荧光PCR方法定量检测HBV cccDNA水平,Alu-PCR检测细胞内HBV S整合基因;应用实时荧光PCR方法定量检测细胞上清液HBV pgRNA和HBV DNA的水平;化学发光试剂检测细胞上清液HBsAg水平。评价未抗病毒时HepG2.2.15细胞模型功能稳定性;描绘TDF抗病毒后各标志物的时间-含量曲线,分析随治疗时间的延长HBV pgRNA、HBsAg、HBV DNA及cccDNA水平变化趋势。应用双变量相关性分析,分析各抗病毒后各检测点上清液HBV pgRNA、HBsAg、HBV DNA变化与肝细胞内cccDNA变化的相关关系。结果(1)未经TDF抗病毒的HepG2.2.15细胞内HBV cccDNA及上清液HBV DNA水平在基线最高,上清液HBsAg水平在培养12d达到分泌高峰;细胞内cccDNA与上清液DNA、HBsAg水平在培养36d内稳定分泌(F=0.604、0.823、1.284,P均0.05);而HBV pgRNA在培养12d达分泌高峰,培养36d内总体水平处于升高趋势(F=8.140,P0.05)。(2)TDF抗病毒后HepG2.2.15细胞内HBV cccDNA及上清液HBV pgRNA、HBV DNA、HBsAg总体水平均呈下降趋势;HBV DNA最先低于检测下限,其次是HBsAg;而pgRNA、cccDNA水平下降缓慢,36d两者均未低于检测值下限。(3)HepG2.2.15细胞基线及抗病毒24d均未检测到HBV S整合基因。(4)TDF抗病毒后细胞内cccDNA与上清液pgRNA总体下降趋势一致,36d均未低于检测值下限。从基线到抗病毒12d、12d到24d、24d到36d时段两者变化幅度均呈完全正相关(r=1.000,p=0.000)。(5)TDF抗病毒后细胞内cccDNA与上清液HBsAg、HBV DNA水平均呈下降趋势,HBsAg和HBV DNA持续性下降于36d内均低于检测值下限,而cccDNA仍可检测到低值阳性;基线到抗病毒12d、12d到24d、24d到36d三个时段,cccDNA变化幅度与HBsAg变化幅度均无相关性(r分别为0.213、-0.016、0.593,p均0.05),与DNA变化幅度也均无相关性(r分别为-0.638、0.550、0.644,p均0.05)。结论(1)外体TDF抗病毒HepG2.2.15细胞模型可用于反映NAs后cccDNA转录活性及转录表达产物消长关系。(2)pgRNA反映细胞内cccDNA含量及转录活性优于HBsAg和HBV DNA,在HBV DNA阴转后有利于继续监测NAs抗病毒治疗效果。(3)pgRNA检测简单无创,作为NAs治疗监测cccDNA转录活性的指标具有广阔的临床应用前景。
【图文】：

（8）旋涡混合器 ：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。2.2.4 基础仪器设备（1）微量移液器 ：德国 Eppe 法国吉尔森；（2）电子精密天平 ：上海衡平电子天平有限公司；（3）SIM-F140AY65 制冰机：上海巴玫实业有限公司；（4）自动高压蒸汽灭菌器 ：致微（厦门）仪器有限公司；（5）超纯水器、-80℃、-20℃、4℃冰箱：美国赛默飞世尔科技公司。2.3 实验方法2.3.1 实验技术路线图

NAs 治疗后 cccDNA 转录活性与 HBV pgRNA、DNA 和 HBsAg 动力学关系的体外研究 2015 级硕士研究生学位论文2.3.2 细胞培养基本条件（1）细胞形态：人肝癌细胞 HepG2 和 HepG2.2.15 形态 致，显微镜下观察细胞贴壁生长，呈抱团样堆积，，形态通透，呈多边形或梭形，如图 2-2。A B
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62

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本文编号：2657213