抗结核药物性肝损伤中组蛋白乙酰化对内质网应激的调控作用

发布时间：2020-05-16 00:58

【摘要】：目的通过在人群研究中分析抗结核药物性肝损伤(anti-tuberculosis drug-induced liver injury,ADLI)患者和非患者抗凝血标本中GRP78的表达水平及其与肝功指标ALT、AST的相关性,并在细胞中予以验证,探讨ADLI中组蛋白乙酰化对内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的调控作用。方法本课题从人群和细胞两个方面进行研究。1人群研究:对2016年7月至2016年12月在唐山市第四医院被诊断为结核病的住院患者的基本情况和抗凝血标本进行收集。将符合条件的63例患者纳入肝损伤组,在非肝损伤患者中进行成组匹配,选择与肝损伤组相匹配的63名患者作为非肝损伤组。ELISA法检测患者血浆中GRP78表达水平。利用两独立样本t检验进行分析,比较肝损伤组和非肝损伤组患者GRP78表达差异,并采用Pearson相关进行GRP78与ALT、AST的相关性分析。2细胞学实验:首先将抗结核药物分为五个加药组,即INH组、RFP组、PZA组、两药组和三药组,CCK8法确定最佳浓度后通过细胞形态学及肝功指标水平确定肝损伤造模成功;其次,利用CCK8法检测不同浓度的C646和MS-275对HL-7702肝细胞的毒性作用,确定两者的最佳浓度;最后,将每个加药组又分为对照组、药物组、C646组、药物+C646组、MS-275组、药物+MS-275组,内质网红色荧光探针标记后观察各药物组细胞的内质网状态,RT-PCR法检测各药物组细胞中P300、HDAC1、GRP78、CHOP的m RNA相对表达量,Western Blot方法检测各药物组细胞中P300、HDAC1、GRP78、CHOP的蛋白含量;微孔板法检测各药物组细胞培养上清液中ALT、AST的表达水平;Annexin V/PI双染法检测各药物组细胞凋亡率水平。结果本研究结果分为两部分。1人群研究结果:与非肝损伤组相比,肝损伤组血浆中GRP78表达明显升高(P0.05),且GRP78与ALT、AST均呈明显正相关(r=0.468,0.386,均P0.05)。2细胞学实验结果:与对照组相比,各药物组中内质网红色荧光均明显减弱,胞浆浓缩,HDAC1、GRP78、CHOP m RNA和蛋白表达量均显著上调(P0.05),P300 m RNA和蛋白含量均明显降低(P0.05),细胞培养上清液中ALT、AST表达水平明显升高(P0.05)且细胞凋亡率上升明显(P0.05);与药物组相比,各药物+C646组细胞中内质网荧光强度变化不明显,HDAC1变化亦不明显,P300、GRP78 m RNA和蛋白含量则明显降低(P0.05),但CHOP表达量显著升高(P0.05),细胞培养上清液中ALT、AST水平及细胞凋亡率再次升高(P0.05);但各药物+MS-275组HDAC1、CHOP m RNA和蛋白水平明显降低(P0.05),GRP78表达显著升高(P0.05),但P300变化不明显,内质网荧光强度减弱更加明显,细胞培养上清液中ALT、AST水平及细胞凋亡率有所降低(P0.05)。结论1 ADLI患者血浆中GRP78表达明显上调,且GRP78含量与ALT、AST呈正相关,在人群中初步证实ERS与ADLI有关。2在细胞中验证ADLI进程中伴随组蛋白乙酰化状态的改变和ERS的发生,且进一步证实组蛋白乙酰化水平的改变参与调控ERS,进而影响肝细胞损伤及凋亡。
【图文】：

细胞,胞质皱缩,肝细胞,存活率

表 6 不同浓度抗结核药物处理后细胞的相对存活率le 6 Relative survival rate of cells in different kinds of anti-tuberculosis药物药物浓度 μg/ml 细胞相对存活率（%）异烟肼组 1000 83.68利福平组 100 82.97吡嗪酰胺组 500 81.10两药组 120+240 83.84三药组 75+150+400 83.80结核药物可使肝细胞发生损伤）HE 染色后于光学显微镜下观察各加药组肝细胞的形态，结果如细胞形态正常，呈梭形或多边形，核大而圆，，位于细胞正中，胞物组肝细胞数量较少，形态趋于扁圆，胞质皱缩，其中两药组和最明显，三药组胞质皱缩最严重，甚至无法观察到胞质，且各药融合的现象。

细胞分泌,细胞形态学,表达水平,抗结核药物

第 2 章实验研究（2）肝功检测指标 ALT 和 AST 在临床上使用频繁，两指标的检测结果有助于增进对肝脏功能的认识及诊断。本研究不仅对 HL-7702 细胞形态学进行观察，还检测了各药物组细胞培养上清液中 ALT、AST 的表达水平。由图 2 可知，各药物组与对照组相比，细胞培养上清液中 ALT、AST 表达水平均明显升高（P<0.05），差异有统计学意义，其中三药组中 ALT、AST 上调最明显，两药组仅次于三药组，说明该组抗结核药对细胞损伤程度最严重。以上细胞形态学和肝功指标结果均表明，抗结核药物致肝细胞损伤模型建立成功。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R52;R575

【参考文献】