建立实时荧光定量PCR检测HBV感染者血清pgRNA水平及其临床意义

发布时间：2020-05-19 09:29

【摘要】：【目的】1建立实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,Real-Time qPCR)方法检测HBV感染者血清前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)水平,评价该方法的性能特点和临床意义;2监测不同临床结局HBV感染者的血清HBV pgRNA水平,分析血清HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性。【方法】1建立Real-Time qPCR方法检测血清中的pgRNA水平1.1 Real-Time qPCR建立设计特异性引物和探针、摸索反应体系和条件、构建质粒标准品、绘制标准曲线等。构建质粒标准品的步骤如下:提取HepG 2.2.15细胞上清液HBV RNA,将其逆转录成cDNA,用上下游引物对上述模板进行常规PCR扩增,PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证为目的片段后进行胶回收、纯化,然后与pEASY~?-Blunt载体连接并转化至Trans1-T1感受态细胞中。筛选出阳性克隆,经菌落PCR、测序验证后,增菌抽提质粒。绘制标准曲线的步骤如下:以构建成功的质粒作为标准品,依据公式换算成拷贝数,用Easy Dilution Buffer将上述质粒准确稀释至1.0×10~(10) copies/ml,再以10倍倍比稀释得到1×10~(10) copies/ml~1×10~1 copies/ml的10个系列浓度的标准品作为反应模板,采用StepOne plus型荧光定量PCR仪进行定量检测。以Ct值为纵坐标,不同浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线。1.2 Real-Time qPCR方法学评价用Real-Time qPCR方法对重组质粒标准品(1×10~100 copies/ml~1×10~1copies/ml)进行检测,评价其线性范围、灵敏性、特异性、重复性、准确性等。1.3 pgRNA的临床意义用自建方法检测不同临床结局HBV感染者血清的pgRNA水平,监测抗病毒药物对pgRNA水平的影响,从而为患者选择合适的停药时机、判断疗效提供参考。2.探讨不同临床结局HBV感染者血清HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性。2.1临床病例和检测指标收集就诊于福建医科大学附属第一医院就诊人群中接受NAs治疗的不同临床结局HBV感染者的血清400例,其中无症状乙型肝炎病毒携带者(asymptomatic hepatitis b virus carrier,ASC)组、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)组、肝硬化(liver cirrhosis,LC)组和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组各100例。HBsAg阴性对照者、其它病毒感染者(包括丙肝患者、EB病毒感染者、单纯疱疹感染者)血清共15例。采用磁珠法提取HBV DNA,离心柱法抽提HBV RNA。采用Architect i4000微粒子化学发光免疫分析仪对HBV血清学标志物HBsAg、HBeAg水平进行定量检测;通过LightCycler 480荧光定量PCR仪对HBV DNA水平进行定量检测;采用StepOne plus型荧光定量PCR仪对血清HBV pgRNA水平进行定量检测。2.2相关性分析分析HBV感染者血清HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性,比较不同临床结局HBV感染者中ASC组、CHB组、LC组和HCC组两两之间其血清HBV pgRNA水平和HBV传统血清学标志物差异,从而为临床抗病毒治疗提供参考。【结果】1建立Real-Time qPCR方法检测血清中的pgRNA水平1.1成功建立Real-Time qPCR确定了该方法的反应条件;成功构建了质粒标准品以及绘制了标准曲线。1.2 Real-Time qPCR方法学评价Real-Time qPCR方法检测标准质粒的线性范围为1×10~100 copies/ml~1×10~3copies/ml;检测下限为1×10~3 copies/ml;批内变异系数在0.13%~0.73%之间;批间变异系数在0.16%~0.63%之间;该方法检测其它病毒感染者的血清HBV pgRNA水平均为阴性,说明该方法具有较好的特异性;用于评价该方法准确度的回收试验的平均回收率为93.785%,符合《中华人民共和国医药行业标准》的规定。1.3 pgRNA的临床意义用Real-Time qPCR方法检测不同临床结局HBV感染者的血清HBV pgRNA水平,同HBV DNA、HBsAg水平比较,分析结果发现,HBV pgRNA水平在ASC组和LC组、ASC组和HCC组、CHB组和LC组、CHB组和HCC组中均具有显著差异{[(4.32±2.36)copies/ml]vs.[(3.22±2.13)copies/ml],[(4.32±2.36)copies/ml]vs.[(3.14±2.12)copies/ml],[(4.41±2.51)copies/ml]vs.[(3.22±2.13)copies/ml],[(4.41±2.51)copies/ml]vs.[(3.14±2.12)copies/ml],均P0.05};HBV DNA水平在ASC组和LC组、ASC组和HCC组、CHB组和LC组、CHB组和HCC组中均具有显著差异{[(4.42±1.72)copies/ml]vs.[(3.68±0.89)copies/ml],[(4.42±1.72)copies/ml]vs.[(3.64±0.65)copies/ml],[(4.7±1.77)copies/ml]vs.[(3.68±0.89)copies/ml],[(4.7±1.77)copies/ml]vs.[(3.64±0.65)copies/ml],均P0.05};HBsAg水平在ASC组和LC组、ASC组和HCC组、CHB组和LC组、CHB组和HCC组中均具有显著差异{[(7393.32±16302.77)IU/ml]vs.[(1831.56±6005.84)IU/ml],[(7393.32±16302.77)IU/ml]vs.[1276.72±1697.07)IU/ml],[6157.9±11583.95)IU/ml]vs.[(1831.56±6005.84)IU/ml],[6157.9±11583.95)IU/ml]vs.[1276.72±1697.07)IU/ml],均P0.05},提示在区别不同临床结局HBV感染者方面HBV pgRNA类比HBV传统血清学标志物有相似的临床意义。2探讨不同临床结局HBV感染者血清HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性收集接受NAs治疗的不同临床结局HBV感染者的血清400例,其中ASC组、CHB组、LC组和HCC组各100例。分析400例HBV感染者不同血清学指标HBV DNA、HBV pgRNA、HBsAg水平两两之间的相关性,发现HBV pgRNA水平和HBV DNA水平的相关性(r=0.58,P0.001)相较于和HBsAg水平的相关性(r=0.47,P0.001)良好,HBsAg水平和HBV DNA水平的相关性(r=0.45,P0.001)良好。另外,我们还分别研究了HBeAg阳性和HBeAg阴性患者中HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性。结果发现HBV pgRNA水平和HBV DNA水平在HBeAg阳性组{[(5.04±2.49)copies/ml],[(4.85±1.97)copies/ml]}中均高于HBeAg阴性组{[(3.11±1.99)copies/ml],[(3.72±0.91)copies/ml]},差异显著(t=9.987,P0.001;t=7.545,P0.001)。HBV pgRNA和HBV DNA水平在HBeAg阳性组(r=0.57,P0.001)和HBeAg阴性组(r=0.32,P0.001)中均呈正相关,但前者相关性较后者良好。此外,我们对400例HBV感染者不同血清学指标统计分析发现,HBV DNA500 IU/ml的标本中HBV pgRNA的检出率是78.9%,提示HBV DNA水平的高低和HBV pgRNA检出率是否有某种关联呢?进而我们从这些标本中选取了108例HBV DNA500 IU/ml的标本,依据HBV DNA水平再细分为HBV DNA20 IU/ml组(74例)和20 IU/mlHBV DNA500 IU/ml组(34例),分析统计HBV pgRNA的检出率,两组检出率分别是17.57%(13/74)和41.18%(14/34),即在HBV DNA20 IU/ml组(74例)中82.43%(61/74)的HBV感染者的HBV DNA水平和HBV pgRNA水平皆低于检测下限。【结论】1成功建立定量检测HBV感染者血清HBV pgRNA水平的Real-Time qPCR方法。该方法具有较好的准确性、敏感性、特异性和较宽的线性范围,适合于临床实验室推广应用。2 HBV pgRNA水平与HBV DNA、HBsAg水平均具有良好的相关性;通过监测不同临床结局HBV感染者HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物水平的动态变化,以了解HBV的感染状态、评价抗病毒治疗效果,有望为不同临床结局HBV感染者进展的判断提供新的、潜在的预测指标之一。
【图文】：

HBV感染,过程,肝细胞,分子

健康的肝细胞再次被感染[14,20]（图 1）。已有研究证实，细胞内最关键的复制中间体是 HBV cccDNA 分子，该分子是 HBV 持续感染的关键因素，患者肝细胞中只要仍残留有HBVcccDNA,当病毒抑制状态被解除后就有可能再次引起病毒的复制活跃，因此，CHB 患者停用抗病毒药物后发生病毒学反弹和疾病复发的最主要原因是残留在肝细胞内的 HBV cccDNA 分子[21]。

电泳图,电泳图,目的,片段

较非正态分布的变量。相关性程度差异有统计学意义。结果构建的序列进行扩增，扩增结束后取 1电泳 40 min 后，电泳结束后将察实验结果（图 1.1）。1 泳道和设计的目的片段长度一致。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62

【参考文献】