肺结核病新型诊断标识的筛选及两种重要分子调控巨噬细胞炎性反应机制研究

发布时间：2020-05-26 23:15

【摘要】：结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性消耗性人畜共患病。我国属于全球结核病疫情高发区。随着环境污染,多耐药菌株的出现和艾滋病传播的不断加剧,结核病的发病率也越来越高,严重威胁着人类健康。结核病防治面临的瓶颈问题是缺乏特异性的早期诊断标识,因此迫切需要寻找灵敏度高、特异性好的分子靶标以及发展低成本,无创取样的检测程序。目前蛋白质组学和转录组学已广泛应用于血液、尿液等各种体液研究中,成为各种疾病研究的组学工具。本研究以肺结核病人的尿液及血液诊断标志物为出发点,从尿液中筛选到能作为肺结核病诊断的生物标志物甘露糖结合凝集素2(MBL2),35 k Da间α胰蛋白酶抑制剂H4(ITIH4-35k),视黄醇结合蛋白4(RBP4)和miR-625-3p,并建立了尿液蛋白质-micro RNA联合诊断模型;从血液中筛选到具有潜在诊断意义的分子标志物miRNA-362-5p,并对其调控结核分枝杆菌介导巨噬细胞炎症反应的具体机制进行了深入研究;同时对结核分枝杆菌RD区炎性蛋白YrbE3A(Rv1964)进行了深入研究,从体内和体外水平证实了YrbE3A激活机体固有免疫的致病机制,为揭示结核分枝杆菌持续致病及RD区蛋白作为结核病特异性诊断抗原提供理论依据。主要研究内容如下:(1)肺结核病新型诊断标志物的筛选及鉴定应用双向电泳和基质辅助激光解吸/电离时间的飞行质谱对45例初治肺结核患者和45例卡介苗免疫健康对照者尿液样本进行了检测,初步筛选出19个差异表达尿蛋白。随后基于Western Blotting和SYBR green q RT-PCR方法对122例初治肺结核患者和73例卡介苗免疫健康对照者尿液样本进行了翻译和转录水平的验证。最终结果显示:MBL2,ITIH4-35k,RBP4具有较高的灵敏度和特异性。进一步对其进行尿蛋白-靶标micro RNA互作网络分析,筛选出11个靶标mcroi RNAs,并利用SYBR green q RT-PCR在痰涂片52例阴性结核患者,46例阳性结核患者和48例健康对照组尿液中进行了验证,确定RBP4和ITIH4-35k的共同靶micro RNA:miR-625-3p具有肺结核病诊断的潜在价值。因此,MBL2,ITIH4-35k,RBP4和miR-625-3p均可作为肺结核病诊断标识独立检测。进一步基于多元逻辑回归构建肺结核尿液临床诊断蛋白和micro RNA联合诊断模型:Y=0.329miR625-3p+0.639MBL2+0.746ITIH4-4.502。联合检测诊断肺结核的诊断效能优于各指标单项检测,敏感性达到85.87%(95%CI 77.05% 92.26%),特异性为87.50%(95%CI 74.75% 95.27%)。新型尿液蛋白和micro RNA诊断标识为结核病的诊断提供新的思路与进步。(2)miR-362-5p对结核分枝杆菌逃避宿主免疫反应调控作用的研究筛选到具有诊断意义的血液学分子标识miRNA-362-5p。在结核分枝杆菌感染的人巨噬细胞(THP-1细胞)和小鼠巨噬细胞(RAW246.7细胞)中miRNA-362-5p的表达显著下调,并具有时间依赖性。对75例临床肺结核病患者,39例鉴别诊断组(肺部疾病病人)和40例健康对照组的外周血淋巴细胞(PBMC)样品中的miR-362-5p的表达水平进行检测,发现miR-362-5p在肺结核组中的表达水平低于肺部疾病组和健康对照组(p0.001)。表明结核分枝杆菌侵染机体,miRNA-362-5p的表达水平在体内和体外均特异性下调。进一步确定了miRNA-362-5p能够通过激活p38 MAPK和NF-κB信号通路正向调控结核分枝杆菌诱导的炎性细胞因子的表达,从而使结核分枝杆菌逃避宿主免疫,增加胞内存活量。同时巨噬细胞通过抑制其吞噬结核分枝杆菌的能力保护自身。(3)结核分枝杆菌蛋白YrbE3A正向调控宿主固有免疫的机制研究为了进一步阐明结核分枝杆菌蛋白YrbE3A与巨噬细胞之间的相互作用机制,构建表达YrbE3A的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS)MS_YrbE3A和卡介苗巴斯德株BCG_YrbE3A,并感染小鼠巨噬细胞(RAW246.7细胞),发现YrbE3A蛋白通过NF-κB和Jnk MAPK信号通路正向调控炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达,激活机体固有免疫杀伤和清除病原菌。随后利用MS_YrbE3A感染C57BL/6小鼠,通过肺组织CFU计数、病理学切片、免疫组化和多因子免疫检测等方法,同样证实了YrbE3A蛋白能够引发高水平炎性细胞因子激活免疫反应从而促进宿主清除耻垢分枝杆菌。综上,本研究筛选到具有潜在诊断意义的分子标识MBL2,ITIH4-35k,RBP4和miR-625-3p,并建立了尿液蛋白质-micro RNA联合诊断模型;确定了肺结核血液诊断标识分子miRNA-362-5p正向调控结核分枝杆菌诱导炎症反应及YrbE3A通过NF-κB/JNK信号通路激活宿主固有免疫,对肺结核的诊断和治疗提供理论依据。
【图文】：

2000 年下降 170 万人）（WHO 2017）（图 1-1）。2015 年提出 终止结核病战略（2016-2035），到 2020 年结核病死亡病例和新发病例人数应在 2015 年的基础上别下降 35%和 20%，，到 2030 年这两个指标要比 2015 年分别下降 90%和 80%（WH2015）。同时，由于 HIV 合并结核感染（40%的 HIV 死亡病例是感染结核造成的和耐多药及多耐药结核菌株，大规模人口流动等问题的出现，增大了结核病疫情控制难度。因此为了控制结核病，减少疾病的流行和提高治疗效果，发展准确、速和简单的诊断方法显得十分迫切。

结核分枝杆菌通常在只存在于器官组织中，血液中一般不含菌，但是血清和 PBMC 可以随全身循环流经致病组织，接受免疫细胞或结核抗原传递的信号。图 1-3 以一个肺结核肺肉芽肿模型演示循环 microRNA 如何应答 MTB 刺激并从感染部位进入血液循环发挥调节作用的。肉芽肿内的巨噬细胞和 T 细胞感受 MTB刺激后调控成熟 microRNA 的种类和表达量，不同的 microRNAs 能够调节不同的信号通路和免疫组分，例如参与肉芽肿形成和维持的 T 淋巴细胞通过上调特异性的microRNA-T 细胞激活获得性免疫。巨噬细胞和 T 细胞中产生的成熟 microRNAs 能够随着外泌体或与高密度脂蛋白或其他蛋白质复合物一起被释放出来，随后通过血管上皮细胞进入全身循环系统。由此，血清和外周血淋巴细胞中的 microRNAs 能够代表这些信号，作为一种新型标志物在结核病的诊断和治疗中( Miotto et al 2013,Zhang et al 2013, Xu et al 2015,Wagh et al 2017)，再加上 microRNAs 具有高度的特异性和敏感性，在结核诊断和治疗中可以发挥巨大的生物学价值。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S855.2;R521

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 黄志梅;;新型农村合作医疗对肺结核病防控效果的研究[J];影像研究与医学应用;2017年15期

2 何爱伟;杨枢敏;王铂;;2007—2016年甘肃省学校教师肺结核病流行状况[J];疾病预防控制通报;2018年04期

3 杨裔;周密;杨帆;张旭辉;汤自力;;2011—2017年长沙望城区肺结核病流行特征分析[J];疾病预防控制通报;2018年05期

4 高雅敏;贾美萍;;肺结核病人痰液检菌的临床经验总结[J];世界最新医学信息文摘;2016年76期

5 朱静;;肺结核病区医院感染危险因素分析和预防研究[J];世界最新医学信息文摘;2016年93期

6 郑健;;辽宁省辽阳市2010-2014年肺结核病疫情特征[J];中国热带医学;2017年03期

7 张晓霞;周访渭;李_g敏;;2010年—2014年灵台县学生肺结核病流行特征分析[J];环境卫生学杂志;2017年01期

8 杨玲;黄建斌;任军辉;;石家庄市鹿泉区肺结核病人就诊延迟情况及相关因素分析[J];医学动物防制;2017年06期

9 唐冠军;;肺结核病发病影响因素及临床治疗方法[J];医疗装备;2016年02期

10 高文宏;杨小玲;黎华锦;蔡虹;曾珂;;延续干预在社区肺结核病人中的应用[J];全科护理;2016年07期

相关会议论文 前10条

1 李君;张淑兰;毛玲琼;;温州市2008-2012年网络直报肺结核病例追踪未到位情况分析[A];2014年浙江省防痨协会第31届学术年会论文汇编[C];2014年

2 王志龙;;惠安县肺结核病人职业特点分析[A];中国防痨协会结核病控制专业委员会学术研讨会论文集[C];2010年

3 李慧丰;;心理治疗在肺结核病治疗中的作用浅析[A];2010年中国防痨协会临床/基础专业学术大会汇编[C];2010年

4 蔡清河;李亚发;林奇娟;;汕头市流动人口肺结核病防治项目实施效果分析[A];2010年中国防痨协会临床/基础专业学术大会汇编[C];2010年

5 张恩莉;肖本波;杜娟;;贵州省兴义市部分学生肺结核病防治知识知晓率问卷调查[A];2011年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2011年

6 吴洁;王忠东;任志盛;陈爱芬;孙海燕;;2007—2010年青岛市肺结核病疫情流行病学分析[A];2011年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2011年

7 李彤;徐江涛;黄东皓;;肺结核病合并曲霉菌病3例并文献复习[A];2011年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2011年

8 阚晓宏;王景红;李志礼;杨建安;陈文化;陈根旺;孙业桓;;在肺结核病人中开展戒烟项目的效果评价[A];2011年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2011年

9 王景红;阚晓宏;李志礼;杨建安;陈文化;陈根旺;孙业桓;;在肺结核病人劝导戒烟项目效果评价[A];中华医学会结核病学分会2011年学术会议论文汇编[C];2011年

10 王小平;;6所高级中学五年高考体验发现56名学生肺结核病例分析[A];浙江省结核病控制学术会议论文汇编[C];2011年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 青山 通讯员 石学林 青松;减轻肺结核病人负担[N];克拉玛依日报;2018年

2 包月妃;我市四类肺结核病人可享免费供药及主要检查[N];赣南日报;2013年

3 河南南阳市第一人民医院中医科 杨峰;家庭如何护理好肺结核病人[N];上海中医药报;2013年

4 吾谷;英提出在25年内消除牛肺结核病[N];中国畜牧兽医报;2013年

5 河北主治医师 刘文山;肺结核病人的饮食调养[N];家庭医生报;2003年

6 记者 卢文洁　通讯员 粤卫信;广州年增过万肺结核病例[N];广州日报;2012年

7 刘涛;我市肺结核病死亡人数十年减少3529人[N];太原日报;2012年

8 董秀晴 周茜;6成肺结核病人是青壮年[N];常州日报;2012年

9 夏瑞平;钙化不是肺结核病痊愈的唯一标志[N];大众卫生报;2004年

10 记者 梁鹏 陈渝 黎奎 实习生 纪文伶;报告肺结核病例 政府有奖[N];重庆商报;2005年

相关博士学位论文 前10条

1 王洁茹;肺结核病新型诊断标识的筛选及两种重要分子调控巨噬细胞炎性反应机制研究[D];华中农业大学;2018年

2 白丽琼;湖南省肺结核病经济负担及其影响因素研究[D];中南大学;2009年

3 罗茂红;2型糖尿病并发肺结核病流行病学特征和危险因素研究[D];天津医科大学;2005年

4 严非;中国结核病控制现状、问题与对策[D];复旦大学;2007年

5 周成超;山东省流动人口肺结核病人求医行为及治疗管理现状与对策研究[D];山东大学;2011年

6 朱红;2型糖尿病并发肺结核病遗传和环境危险因素探讨[D];天津医科大学;2006年

7 张星;肺结核病生物学标志物miRNAs筛选、鉴定及miRNA和MRC1 SNPs与肺结核病易感性的研究[D];浙江大学;2014年

8 刘姬艳;基于蛋白组学的肺结核病及其中医证候血清标志物筛选与鉴定[D];浙江大学;2013年

9 饶华祥;基于时空聚集面板模型的肺结核病高危区域探测及影响因素研究[D];山西医科大学;2017年

10 李翠萍;结核易感标志物和血清标志物的研究[D];广西医科大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 陈婧;青海地区藏、汉民族肺结核病血清单核细胞趋化蛋白-1水平分析[D];青海大学;2018年

2 冯斐;青海地区藏、汉民族肺结核病的IL-12、SP-A表达水平分析[D];青海大学;2018年

3 王聪;MBL基因多态性与青海汉族肺结核病易感性的相关性研究[D];青海大学;2017年

4 田玲玲;山东省肺结核病人心理健康状况及影响因素研究[D];山东大学;2013年

5 徐晓青;肺结核病人手机及网络利用情况及其影响因素研究[D];山东大学;2013年

6 杨德香;肺结核病发病影响因素及其疫情预测模型的研究[D];重庆医科大学;2011年

7 刘颖;重庆地区乡村医生在肺结核病人发现中的作用及其影响因素研究[D];重庆医科大学;2009年

8 张洪梅;山东省肺结核病的空间分布及其影响因素研究[D];山东大学;2009年

9 李慧娟;山东省肺结核病人生活满意度及其影响因素研究[D];山东大学;2009年

10 孙付胜;河口区集中推荐筛查肺结核病人效果的影响因素分析[D];山东大学;2006年

本文编号：2682550