水痘-带状疱疹病毒（VZV）感染与细胞自噬的相关研究

发布时间：2020-05-27 10:02

【摘要】：背景水痘一带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)具有嗜皮肤、神经、淋巴细胞的特性,感染人体可引起水痘及带状疱疹,目前关于VZV感染机制的阐释尚不明确。自噬是一种细胞内降解途径,研究表明细胞自噬可防御病原体感染,而许多病原体,包括多种人类疱疹病毒进化出多种机制来逃避、抑制甚至利用自噬。信号传导及转录激活因子3(Signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)在调节自噬过程中发挥重要作用,并且作为转录因子可调控多种病毒的复制和扩散。目的明确VZV感染与自噬的相互关系,并探讨STAT3信号通路在VZV感染中对自噬和病毒复制的调节作用。方法1.流式细胞术检测35例带状疱疹患者外周血CD4+T淋巴细胞中自噬蛋白LC3B,Beclin-1、p62的表达情况,30例健康成人作为对照组;获取12例带状疱疹患者皮损区标本,免疫组化法检测皮肤组织中相关自噬蛋白的表达,透射电镜观察皮肤细胞内自噬体的生成。2.VZV感染的SHSY5Y细胞中,MDC荧光染色观察自噬体,western-blot检测自噬蛋白LC3B-Ⅱ,Beclin-1、p62的表达。经自噬诱导剂海藻糖和自噬抑制剂3-MA处理感染细胞后,检测VZV滴度,q-PCR检测VZV DNA拷贝值,western-blot 检测 VZV 糖蛋白 E(glycoprotein E,gE)表达的变化。3.VZV感染的SHSY5Y细胞中,western-blot检测STAT3、及其下游因子BNIP3的表达及磷酸化情况;经S3I-201阻断STAT3通路后,检测自噬蛋白及VZV复制的变化;经S3I-201阻断STAT3通路后,应用自噬诱导剂海藻糖,检测自噬蛋白及VZV复制的变化。结果1.带状疱疹患者外周血CD4+T细胞中、皮损区皮肤组织中自噬蛋白LC3B,Beclin-1的表达明显增高(P均0.05),p62的表达明显降低(P0.05),皮损区皮肤细胞中自噬体数量明显增高(P0.05)。2.VZV感染的SHSY5Y细胞中,自噬蛋白LC3B-Ⅱ,Beclin-1的表达明显增高(P均0.05),p62的表达明显降低(P0.05),对自噬进行诱导/抑制后,病毒滴度明显升高/降低,VZV DNA拷贝值明显升高/降低,VZV gE的表达明显升高/降低(P均0.05)。3.VZV感染的SHSY5Y细胞中,STAT3的表达及磷酸化、其下游因子BNIP3的表达明显升高(P均0.05),抑制STAT3后,自噬水平明显下降,VZV复制减弱,而自噬诱导剂海藻糖可逆转这种减弱(P均0.05)。结论VZV感染后,T淋巴细胞、皮肤组织、神经细胞中自噬水平升高,自噬的发生对病毒复制产生正性影响,此外,在VZV感染中,STAT3-BNIP3通路的活化可通过正性调控自噬的表达而调控VZV复制。探讨病毒感染性疾病中自噬及其调节通路的作用,将为研究病毒复制机制及病原体-宿主相互作用机制提供见解。
【图文】：

图１－１外周血单个核细胞分离逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ邋ｂｌｏｏｄ邋ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ邋ｃｅｌｌｓ邋（ＰＢＭＣ）邋ｗｅｒｅ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ逡逑（５）向外周血单个核细胞沉淀中滴加适量的１０％ＮＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养逡逑液，小心吹打混匀，用巴氏吸管吸取少量悬液，进行细胞计数与细胞活力检测：逡逑①细胞计数：滴１滴细胞悬液于血球计数板上，盖盖玻片后静置片刻，移至显微镜下，观察并统计４角四个大方格中的细胞数，算出细胞总数，并计算、逡逑调整细胞浓度为１邋Ｘ邋１0６／１00邋ｕ邋Ｌ。逡逑②台盼蓝染色法检测细胞活力：用ＰＢＳ液将４％台盼蓝母液稀释为０．４％的浓逡逑度。随后，将细胞悬液与０．４％台盼蓝工作液９：１混合，滴加到载玻片上，并覆盖玻片，转移至显微镜下，，观察统计活细胞（未染色细胞）与死细胞（染为色的细胞）的数量，计算出活细胞的比例。细胞存活率应大于９０％。逡逑（６）将新鲜外周血所分离出的单个核细胞，保存在４°Ｃ冰箱内。２４小时内逡逑进行抗体标记，上机流式检测自噬蛋白ＬＣ－３Ｂ，Ｂｅｃｌｉｎ－］，ｐ６２在ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞逡逑

（５．７５±０．６７）邋％，而健康成人对照组外周血中ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞中自噬相关蛋白逡逑ＬＣ３Ｂ、Ｂｅｃｌｉｎ－１、ｐ６２邋的表达阳性率分别为（３６．５６±４．２７）邋％、（１５．３４±１．８９）邋％、逡逑（１０．０３±１．１５）邋％邋（图１－２）。与健康成人对照组相比，带状疱疹患者ＣＤ４＋Ｔ淋逡逑巴细胞中自噬相关蛋白ＬＣ３Ｂ，Ｂｅｃｌｉｎ－１的表达明显增高（ＰＣ０．０１）邋，邋ｐ６２的表逡逑达明显降低（Ｐ＜０．０１）。这表明ＶＺＶ感染后ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞中自噬水平增高，逡逑并且自噬流是通畅的。逡逑１７逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R511.5;R752.12

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本文编号：2683367