LFLIU联合载左氧氟沙星纳米粒对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的杀菌效果研究

发布时间：2020-05-31 02:28

【摘要】：研究意义目前,结核病(Tuberculosis,TB)仍然是世界范围内的一个重大公共卫生问题。TB是全球死亡人数最多的传染病,其病原菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)细胞壁厚、通透性差,并且它主要寄生在巨噬细胞(Mф)内,导致药物难以渗透MTB的双重障碍而耐药,TB的控制依然面临严峻挑战,临床上迫切需要寻找新的抗结核感染治疗新方法,为此,本文研究了LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS)的生物学效应和杀菌机制,有望为结核病的治疗提供一种无创、安全、有效的方法。目的探讨LFLIU联合载药PLGA纳米粒突破Mф、MTB细胞壁双层屏障的杀菌效果及机制,有望显著缩短结核病化疗疗程,为陷入困境的结核病治疗带来新突破。方法1.LFLIU对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的损伤效应:选用频率为42KHz,换能器直径45mm,输出声强范围0.13~0.34 W/cm~2连续可调的超声波发射仪。分别用声强0.14 W/cm~2、0.33 W/cm~2的超声辐照巨噬细胞RAW264.7 0、5、10 min和15 min,筛选出对巨噬细胞活性无明显影响的超声辐照剂量。(1)建立耻垢分枝杆菌感染RAW264.7细胞吞噬模型,用声强0.14 W/cm~2的超声分别辐照该感染细胞0、5、10 min。(2)选用正常RAW264.7细胞,用声强0.14 W/cm~2的超声分别辐照0、5、10 min。实验后,分别采用流式细胞术检测RAW264.7细胞的凋亡率和坏死率,使用平板计数法评估RAW264.7细胞内耻垢分枝杆菌的活性,使用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察并定量RAW264.7细胞经超声辐照后产生的活性氧。2.LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对巨噬细胞RAW264.7内耻垢分枝杆菌的杀菌作用和机制:(1)采用双乳化法制备载左氧氟沙星PLGA纳米粒,利用马尔文激光粒度仪检测该纳米粒的粒径,电位和多分散性;在电镜下观察它的形态和内部结构;测量载药纳米粒72h内药物自然释放率及一定超声辐照后药物的释放率;比较游离左氧氟沙星和载左氧氟沙星纳米粒分别对RAW264.7细胞的毒性作用。(2)将被感染耻垢分枝杆菌的巨噬细胞分为6个组(N=3):对照组、游离左氧氟沙星组、载左氧氟沙星纳米粒组、单独超声辐照组、超声联合游离左氧氟沙星组、超声联合载左氧氟沙星纳米粒组。实验后,用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪观察和检测LFLIU对载左氧氟沙星纳米粒的吞噬情况以及细胞内产生的活性氧,同时用流式细胞仪分析被处理后的RAW264.7细胞的坏死率和凋亡率,用透射电镜观察巨噬细胞和细胞内耻垢分枝杆菌的结构变化,通过菌落计数法评估RAW264.7细胞内耻垢分枝杆菌的存活情况。结果1.成功制备了物理特性好的载左氧氟沙星PLGA纳米粒:(1)扫描电镜下观察呈球形,形态均一、分散性良好,透射电镜下可见药物被包封于PLGA纳米粒内部。(2)纳米粒性能稳定,Zata电位为-20.8±4.25mV,粒径较小,仅为229.8±?12.1nm,载药率和包封率分别是(8.36?±?0.74)%、(84.74?±?1.28)%。(3)连续监测了72h内载药纳米粒内药物的释放,72h后,超声处理组约有74%的左氧氟沙星被释放出来,对于未经超声处理的自然释放组,大约只有39%的药物被释放,结果表明超声可诱导纳米粒内左氧氟沙星的释放。(4)PLGA纳米粒内药物浓度在一定范围内时,对巨噬细胞无细胞毒性。2.一定剂量的LFLIU对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的损伤效果显著:用不同声强和时间辐照巨噬细胞及吞噬模型,结果提示:(1)用声强0.33 W/cm~2的LILIU辐照巨噬细胞5、10、15min以及用声强0.14W/cm~2的LFLIU辐照巨噬细胞15 min时,巨噬细胞的存活率低于75%,影响巨噬细胞的活性,当超声强度为0.14 W/cm~2,辐照时间为5、10 min时,对巨噬细胞的生长活性影响较小,此时巨噬细胞存活率分别为(116.37±9.54)%,(97.14±9.26)%。(2)用声强0.14 W/cm~2的超声辐照RAW264.7细胞10 min时,耻垢分枝杆菌的吞噬率达到了58.55%,而假照组吞噬率为32.47%,表明LFLIU可以促进巨噬细胞对耻垢分枝杆菌的吞噬。(3)当RAW264.7细胞感染耻垢分枝杆菌后,用声强0.14W/cm~2的LFLIU辐照5 min,细胞凋亡率和坏死率高于超声辐照0 min(P0.01),但LFLIU辐照10min时,细胞凋亡率和坏死率未进一步增加。(4)用声强0.14 W/cm~2的LFLIU辐照10 min时,RAW264.7细胞内活性氧浓度高于超声辐照5 min(P0.01),结果提示随着LFLIU辐照时间的增加,细胞内活性氧浓度增加。(5)用声强0.14 W/cm~2的LFLIU辐照0、5、10min后,RAW264.7细胞内的耻垢分枝杆菌活菌数分别为(4.64±0.21)×10~5 CFU/mL,(3.73±0.21)×10~5,(2.20±0.21)×10~5 CFU/mL,表明RAW264.7细胞内耻垢分枝杆菌菌活力随着LFLIU辐照时间的增加而降低,最佳LFLIU辐照剂量为声强0.14 W/cm~2,辐照时间10min。3.LFLIU协同载左氧氟沙星PLGA纳米粒对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的杀菌效果显著:(1)声强0.14 W/cm~2LFLIU处理10min后,巨噬细胞对纳米粒的吞噬率为54.86±7.45%,假照组的吞噬率为33.18±4.16%,差异有统计学意义(P0.01),表明LFLIU能促进巨噬细胞对纳米粒的吞噬。(2)LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒可显著诱导细胞内活性氧的产生,超声联合载药纳米粒,活性氧荧光强度达到了1844.3±46.7,约为对照组(993.9±47.5)的两倍。(3)与对照组相比,超声联合载药纳米粒的凋亡率为(21.25±1.15)%,差异有统计学差异(P0.01),提示超声联合载左氧氟沙星纳米粒促进巨噬细胞的凋亡。(4)一定剂量的LFLIU联合载左氧氟沙星纳米粒可对RAW264.7细胞自身产生损伤效应,透射电镜下观察到超声处理后,巨噬细胞部分微绒毛消失,细胞核体积减小、染色质浓缩,巨噬细胞内耻垢分枝杆菌受到严重损伤,耻垢分枝杆菌壁破裂,结构不完整,脂滴和糖原含量增加。(5)LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对巨噬细胞内的耻垢分枝杆菌的杀菌率为82.2%,显示出高于对照组(不用药物处理,也不用超声处理)10倍的抗菌活性。结论1.一定剂量的LFLIU可促进RAW264.7细胞对耻垢分枝杆菌的吞噬作用,单独超声可损伤巨噬细胞内耻垢分枝杆菌。2.LFLIU联合载左氧氟沙星PLGA纳米粒对RAW264.7细胞内耻垢分枝杆菌的增效杀菌作用显著。
【图文】：

图 3 LFLIU 对 RAW264.7 细胞凋亡和坏死的影响Fig. 3 Effect of LFLIU on apoptosis and necrosis of RAW264.7 cells表 2 RAW264.7 细胞凋亡率和坏死率（ , %）Tab. 2 Apoptotic and necrotic rates of RAW264.7 (%)声强（0.14 W/cm2）辐照时间（min）0 5 10加入 MS菌凋亡率 7.37±1.76 18.34±1.28b5.10±0.46坏死率 6.51±1.08 17.90±1.48b5.47±1.37无 MS 菌加入凋亡率 4.75±0.98 12.96±0.75b2.38±1.42坏死率 1.26±0.27 5.70±0.41b3.26±1.57a

图 4 LFLIU 对 RAW264.7 细胞内 MS 的活力影响Fig. 4 The effect of LFLIU on the activity of MS in RAW264.7 cells LFLIU 刺激 RAW264.7 细胞产生活性氧流式细胞术分析活性氧水平的变化，结果显示荧光曲线向右位移（图 5），表声辐照 10 min 组 RAW264.7 细胞内 ROS 浓度高于超声辐照 5 min 组。用激光焦显微镜观察 RAW264.7 细胞内 ROS 的水平（图 6），结果显示随着超声辐间的增加，ROS 浓度增加，，这和流式细胞仪测得的定量结果是相同的。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R52

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本文编号：2689126