OAS1基因上功能性SNP位点与中国汉族干燥综合征并发HBV感染的遗传关联性研究

发布时间：2020-05-31 04:31

【摘要】：近年来,干燥综合征(Sj?gren’s syndrome,SS)作为一种常见的自身免疫性疾病,其复杂的致病机制和发病过程已引起众多研究者的重视。虽然全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)报道了与疾病相关的易感基因,也有多个遗传学关联研究阐明不同的单核苷酸多态性(Single nucleotide ploymorphism,SNP)与疾病的关联性,同时研究者们已鉴定出干扰素(Interferon,IFN)信号通路相关基因从遗传学水平和分子免疫学水平对疾病的发生进行调控,但是干燥综合征的具体发病机制仍不明确,进而阻碍了临床治疗和药物研发的进展。因此,对干燥综合征发病机制的研究具有重要意义。本课题组长期收集中国汉族干燥综合征样本,本研究共使用1455例健康对照和588例疾病人群,我们从全血样本中提取基因组DNA以及分离外周血单核细胞(PBMC),根据实验需要提取PBMC m RNA或构建永生化B淋巴母细胞系。首先我们通过遗传学技术鉴定了OAS1(2'-5'-oligoadenylate synthetase 1)基因功能性位点rs10774671与中国汉族干燥综合征的遗传关联性,发现该位点与干燥综合征具有遗传关联作用(P=0.0398,odds ratio/OR=0.85);接下来我们整合了患者的抗SSA抗体信息,用统计学方法分析后发现rs10774671与抗SSA抗体阳性的干燥综合征相关(P=8.0×10-5,OR=0.85),与抗SSA抗体阴性的干燥综合征无关联性(P=0.1725);同时,我们也整合了患者抗核心抗体(HBc)信息,发现该位点与抗SSA抗体阳性/抗HBc抗体阳性的干燥综合征具有遗传关联(P=0.0059,OR=0.36),与抗SSA抗体阳性/抗HBc抗体阴性的干燥综合征不相关(P=0.3746,OR=1.24)。OAS1是干扰素信号通路的重要因子,其5号内含子上功能性SNP位点rs10774671与多种自身免疫病表现出相关性,包括多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)和I型糖尿病(Type 1 diabetes,T1D)。本研究结果首次鉴定出在中国汉族人群中OAS1基因位点rs10774671与干燥综合征具有遗传关联,这与同期报道的该位点在欧洲干燥综合征人群中的遗传关联性相符,进一步验证了OAS1在该病中的遗传易感性;同时,rs10774671与抗SSA抗体阳性的干燥综合征相关,抗SSA抗体作为该病的自身反应性抗体,抗原SSA/Ro60被认为可以促进疾病的发生,此结果提示了OAS1与SSA/Ro60间可能存在潜在地协同致病关系。另外一组关联分析数据表明rs10774671与抗SSA抗体阳性/抗HBc抗体阳性的干燥综合征相关,这一结果首次从遗传学水平证明了OAS1与中国汉族干燥综合征并发HBV病毒感染的遗传关联,目前HBV感染在不同种族的干燥综合征患者中表现出相异的关联性,鉴于我国是HBV感染高发地区,结合中国特殊的流行病学特征,明确中国人群中HBV感染与干燥综合征发病的遗传关联作用和分子机制,具有重要的临床意义。在明确rs10774671位点与疾病的遗传关联作用后,我们进一步鉴定了该位点与疾病样本中OAS1基因表达的关系。首先我们分别在“G/G”、“G/A”、“A/A”基因型的对照组和疾病组样本中检测了总OAS1基因表达,发现无论在干燥综合征患者还是正常健康人群中,rs10774671位点与总OAS1基因表达均无关联;但是将抗SSA抗体阳性患者与抗SSA抗体阴性患者相比,前者中总OAS1基因表达显著增强。鉴于OAS1是干扰素调控的下游基因,我们还检测了rs10774671与干燥综合征患者的OAS1基因在受到干扰素刺激后表达变化之间的关系,结果证明二者无相关性。同时,我们通过生物信息数据库分析,发现与rs10774671表现连锁不平衡关系(r20.95)的SNP位点,部分分布在OAS3基因启动子区域,为探究OAS3在干燥综合征发病过程中发挥的作用,我们同样检测了rs10774671位点与对照组、疾病组和干扰素刺激的疾病样本中总OAS3基因表达的关系,结果显示该位点与OAS3基因表达没有关联。根据上述结论,rs10774671与疾病的发生具有显著遗传关联,然而基因表达数据表明该位点与总OAS1 m RNA表达无关,为进一步阐述rs10774671位点基因型突变后的致病机制,我们检测了四种OAS1蛋白亚型(Transcript variant,TV)在疾病样本中的基因表达与基因型的关系。已知rs10774671位点上发生“G”到“A”突变后,m RNA剪切前体无法识别原有序列引起错误切割,因而形成三种新蛋白亚型(OAS1 TV2、TV3、TV4,对应野生型OAS1 TV1、)。我们根据各亚型序列特点,分别设计了特异性OAS1蛋白亚型引物序列,在三种基因型的疾病样本中鉴定了各亚型的蛋白表达。结果表明在野生纯合子样本中,OAS1 TV1亚型基因表达增强,而在突变基因型样本中,OAS1 TV2、TV3、TV4亚型表达增强。这一数据揭示了当SNP位点的等位基因发生变化时,机体表达出不同的OAS1蛋白亚型,结合新亚型应答免疫能力降低的现象,我们从分子生物学水平阐明rs10774671基因突变的人群更易罹患干燥综合征。已知OAS1蛋白可以通过Jak-STAT信号通路抵抗HBV病毒的感染与复制活性,为深入探究本研究中rs10774671位点与HBV感染关联的分子机制,我们分别构建了四种OAS1亚型的表达载体,与HBV病毒表达载体共同转染到肝细胞中,通过Western Blot、ELISA和荧光定量PCR的方法检测细胞内和上清中的HBc抗原的表达,发现OAS1 TV1亚型的抗病毒能力明显强于其他三种亚型。因此,当rs10774671位点发生突变后,OAS1 TV1亚型蛋白表达降低,OAS1 TV2、TV3、TV4亚型表达增强,但是新亚型的抗病毒能力下降,这一结论揭示了携带突变基因“A”的人群更易感染HBV病毒。本研究首次鉴定了OSA1基因上功能性SNP位点rs10774671与中国汉族干燥综合征并发HBV感染的遗传关联,并验证了rs10774671调控干燥综合征发病和HBV感染的分子机制,有助于研究者们加强对于干燥综合征易感基因和发病机制的认识,为推进疾病的治疗奠定了基础。
【图文】：

干燥综合征

致机体自身的免疫系统攻击自体的健康组织和细胞，因而产生病变 1933 年首次被描述，目前在我国的发病率可达 0.77%，女性患病比例九倍[3, 4]，通常在女性中年时期发病。根据发病方式的不同，该病可分干燥综合征（primary Sj gren’s syndrome，pSS）和继发性干燥综condarySj gren’ssyndrome，sSS），本文以原发性干燥综合征为主展开讨干燥综合征的主要临床症状为淋巴细胞侵润泪腺、唾液腺等外分泌进而液的产生，临床常见表现包括眼睛干燥（干眼症或干燥性角膜结膜炎）燥症（图 1.1）[5]。干燥性角膜结膜炎通常在患者体内潜伏数年；干眼症发角膜溃疡和眼睑感染[6]。干燥综合征导致的口腔干燥可能会影响患者，并且在夜间也需要频繁的饮水，，同时唾液的保护和抗菌特性的丧失可龋齿产生进而促进患者罹患口腔念珠菌病、腮腺肿胀和其他干燥症，如、皮肤和阴道的干燥。干燥综合征患者临床表现多样化，轻重程度不一展严重时还会累积肾脏、肺和肝脏等器官，甚至威胁生命[7, 8]。

自身抗原,双链,红色,单链

自身抗原蛋白（白色）结合双链 Y RNA（红色）和色）的末端。e Ro autoantigen protein (white) binds the end of a doubRNA (red) and a single stranded RNA (blue). PDB: 1YV缺陷分子的降解。SSA/Ro60还可以与细胞中的RNApstein-Barr 病毒（EBV）的早期 RNA1（EBER1），S出以抗核糖体和抗染色质抗体以及肾小球肾炎为特 SSA/Ro60 可能在预防系统性自身免疫疾病中具有重Ro60 作为可提取核抗原家族的重要成员之一，具有在lupuserythematosus，SLE）或原发性干燥综合征的患能力[15]，同时抗 SSA 自身抗体与这些疾病中的炎症上述结果为基础，研究者提出 SSA/Ro60 识别宿主内[18
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.2;R512.62

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