肝脏免疫耐受与HBV诱发肝癌

发布时间：2020-06-03 05:15

【摘要】：慢性乙肝病毒(HBV)感染可导致肝脏纤维化,肝硬化,最终发展成为肝癌。病毒学家将HBV致癌归因于病毒DNA的整合以及调节蛋白HBx的致癌作用,但是越来越多的研究表明HBV病毒是非细胞病变的病毒，HBV介导肝细胞癌(HCC)发生的主要原因是机体免疫系统在清除HBV过程中对感染HBV的肝细胞发生免疫应答造成了肝脏损伤,持续的肝脏损伤导致肝癌的发生。肝脏是一个特殊的免疫耐受器官,肝脏中的免疫细胞主要呈现出免疫耐受状态。临床上的乙肝携带者,以及HBV转基因小鼠中,肝脏中CD8+T细胞由于高表达抑制性受体而处于免疫抑制状态,并无肝脏损伤产生;而当肝脏免疫耐受环境被打破,免疫细胞被激活,其在清除病毒的过程中引起的免疫应答能导致肝脏炎症的发生。在肿瘤的研究中发现,共抑制性受体TIGIT(T cell immunoglobulin and immune receptor tyrosine-based inhibitory motif domain)是 CD4+ T 细胞和 CD 8+ T 细胞耗竭的标志。其次,TIGIT分子也高表达于活化的T细胞表面,当与抗原呈递细胞上的配体CD155结合后能抑制T细胞的功能。我们实验室前期研究已经发现肝脏T细胞高表达TIGIT分子。TIGIT分子在HBV免疫耐受的维持中是否发挥了重要作用?阻断TIGIT通路是否可以打破HBV耐受,进而导致肝癌的发生?为此我们进行了深入探讨,取得的主要实验结果如下:1 HBs-tg小鼠TIGIT阻断或缺失诱发慢性肝炎对HBs-tg小鼠TIGIT阻断后,小鼠肝脏出现持续性谷丙转氨酶(ALT)升高的现象:肝脏病理染色可以看出血管附近有大量白细胞浸润;天狼星红染色可以看出肝脏出现了一定的纤维化;TUNEL染色显示TIGIT阻断后,HBs-tg小鼠肝脏中凋亡细胞比例上升。此外,HBs-tgTIGIT-/-小鼠出现自发的慢性肝炎。2 HBs-tg小鼠TIGIT阻断或缺失联合疫苗免疫诱发肝细胞癌在TIGIT阻断3个月后,对该小鼠进行HBsAg疫苗免疫,约有63.64%的HBs-tg小鼠在免疫后2个月产生肝细胞癌。直接对HBs-tgTigit-/-小鼠进行HBsAg疫苗免疫,有61.54%比例的小鼠产生肝细胞癌。3 HBs-tg小鼠随年龄增长肝脏CD8+ T细胞TIGIT表达升高通过流式细胞术分析2个月(m),6m，10m的HBs-tg小鼠和野生型小鼠(WT)肝脏和脾脏中CD8+T细胞的抑制性分子表达,我们发现HBs-tg小鼠肝脏中CD8+T表达TIGIT水平显著高于WT小鼠,且随着年龄增长,TIGIT表达升高,而脾脏中CD8+T细胞TIGIT表达不变。PD-1表达也具有相同的趋势,即HBs-tg小鼠肝脏CD8+ T随着年龄增长逐渐上调PD-1分子的表达,且显著高于WT小鼠。4TIGIT阻断后HBs-tg小鼠肝脏中CD8+T细胞数目增多,活化增强,并出现抗原特异性CTLsTIGIT阻断后,HBs-tg小鼠肝脏中T细胞和CD8+T细胞比例和数目显著高于对照小鼠,且出现了一群抗原特异性CD8+细胞毒T细胞(CTLs)。进一步流式分析显示,TIGIT阻断后,肝脏CD8+T细胞活化增强,表现为CD69表达升高,且CD44hiCD62Llow比例升高,CD127+CD62L+中心记忆性T细胞比例减少,提示抗原刺激后,中心记忆性CD8+ T细胞分化成效应性T细胞,参与免疫应答。此外,CD8+T细胞分泌IFN-γ和CD107a水平升高。HBs-tg Tigit-/-小鼠相比于同窝对照的HBs-tg小鼠,其肝脏CD8+ T细胞分泌IFN-γ水平显著升高。5清除CD8+ T细胞的HBs-tg小鼠阻断TIGIT肝损伤明显减轻对HBs-tg小鼠清除CD8+T细胞后,再对其进行TIGIT阻断,则ALT不再升高,病理染色显示肝脏中炎性浸润明显减少。若对TIGIT阻断后的HBs-tg小鼠在疫苗免疫期间清除CD8+T细胞,则不会发展成为肝癌。结论:HBs-tg小鼠中CD8+ T细胞表面高表达的TIGIT分子,维持了肝脏对HBV的免疫耐受,若阻断TIGIT通路,肝脏免疫耐受环境打破,CD8+T细胞活化水平提高,分泌细胞因子水平和杀伤功能明显增强,进而攻击病毒感染的肝细胞,导致肝实质细胞的损伤和凋亡,使肝脏产生慢性炎症,长期的慢性炎症促进了肝细胞癌的发生。
【图文】：

病毒清除,杀伤性,肝炎,细胞

图１．邋１杀伤性ＣＤ８＋Ｔ细胞介导肝炎和病毒清除的机制（引自ＧｕｉｄｏｔｔｉａｎｄＣｈｉｓａｒｉ，逡逑２００６）逡逑图注：ＨＢＶ抗原特异性ＣＴＬｓ通过Ｆａｓ邋Ｌ和穿孔素介导的方式来杀伤肝实质细胞。ＨＢＶ抗逡逑原特异性ＣＴＬｓ分泌抗病毒的细胞因子来抑制病毒的复制，以一种非细胞病变的方逡逑式。并且活化肝脏中实质细胞和非实质细胞来分泌趋化Ｈ子。逡逑辅助性Ｔ细胞（ＣＤ４＋邋Ｔ－ｈｅｌｐｅｒ邋ｃｅｌｌｓ）则主要是通过促进病毒特异性ＣＤ８＋邋Ｔ逡逑细胞的产生和维持稳态来参与抗病毒的过程。与此猜测一致的是，研究发现人和逡逑黑猩猩中，ＨＢＶ或者ＨＣＶ特异性ＣＤ４＋邋Ｔ细胞应答的强度和ＣＤ８＋邋Ｔ细胞应答逡逑强度相关（Ｃｈｉｓａｒｉ邋ａｎｄ邋Ｆｅｒｒａｒｉ，邋１９９５；邋Ｓｈｏｕｋｒｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００４ａ）。尽管有体外实验发现，逡逑辅助性Ｔ细胞有杀伤能力，但是他们在病毒感染过程中致病作用的研究却不清逡逑楚。此外也有研究发现，在急性ＨＢＶ感染的黑猩猩中，在病毒血症发生的顶峰逡逑时清除0４＋丁细胞并不能减轻肝损伤（丁１１丨１１１１＂＾６１３丨．，２００３）。以上结果说明，曰８NB逡逑和ＨＣＶ感染中，病毒特异性ＣＤ４＋Ｔ细胞可能并不是直接介导肝损伤。他们更逡逑

免疫细胞,肝脏,细胞

图１．邋２肝脏中的免疫细胞（引自Ｒａｃａｎｅｌｌｉ邋ａｎｄ邋Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，邋２００６）逡逑图注：Ｂ，Ｂ细胞；ＤＣ，树突状细胞；ＨＳＣ，肝脏星形细胞；ＫＣ，肝脏巨噬细胞；ＮＫ，自然逡逑杀伤细胞；Ｔ，邋Ｔ细胞。逡逑ＮＫ细胞可以通过他们的活化性受体和抑制性受体来平衡促炎性细胞因子逡逑（Ｔｈｌ）和抗炎性细胞因子（Ｔｈ２）的产生来调节肝脏损伤。在抑制性信号缺失和逡逑Ｉ型干扰素及其诱导产生的ＣＣＬ３存在的情况下，，ＮＫ细胞活化性受体与配体相结逡逑合，导致ＮＫ细胞活化并且靶细胞被裂解（Ｓａｌａｚａｒ－Ｍａｔｈｅｒｅｔａｌ．，１９９８）。ＮＫ细胞活逡逑化的情况下也会大量分泌ＩＦＮ－丫，而ＩＦＮ－ｙ能刺激肝实质细胞和肝窦内皮细胞分泌逡逑趋化因子ＣＸＣＬ９，接着招募Ｔ细胞进入肝脏（Ｉｔｏｈｅｔａｌ．，邋２００１）。ＮＫＴ细胞可以识逡逑别脂质抗原和分歧杆菌细胞壁上的糖脂类组成成分。该识别是由肝细胞或者抗原逡逑呈递细胞，例如巨噬细胞，ＤＣ细胞和Ｂ细胞上的ＣＤ１分子所介导的（Ｂｅｎｄｅｌａｃｅｔ逡逑ａｌ，，１９９５；Ｃａｍａｕｄｅｔａｌ．，１９９９）。ＤＣ细胞，Ｋｕｆｆｅｒ细胞分泌的ＩＬ－１２可以促进ＮＫＴ细逡逑胞的活化，进而使ＮＫＴ细胞介导Ｆａｓ依赖的细胞裂解（Ｂｅｎｄｅｌａｃｅｔａｌ．，１９９７）。这种逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62;R735.7

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