miR-145-3p、IL-16在脊柱结核先天免疫功能中作用的实验研究

发布时间：2020-06-05 04:50

【摘要】：[目的]结核病(TB)是全球重大公共卫生问题之一,可分为肺结核和肺外结核病,其中,脊柱结核(STB)是较为常见的肺外结核。无论何种结核病,均由结核分枝杆菌(MTB)感染宿主并在宿主内复制、增殖而发病。从细胞水平而言,MTB感染宿主后可被巨噬细胞吞噬而清除,同时,MTB也可在巨噬细胞内长期存活,并在一定条件下复制、增殖而扩散,最终导致结核病发生,因此,巨噬细胞的吞噬、增殖及凋亡等直接影响机体对MTB的作用。然而,巨噬细胞与MTB的相互作用极其复杂,目前结核病的发病机制尚未完全清楚。近期的研究表明:微小RNA在结核病的发生中起重要的调节作用。我们前期结果及相关研究也表明miR-145在肺结核及结核性脊柱炎中可能发挥重要作用,但一个微小RNA具有多个潜在的靶基因,其具体的调控机制仍有待于进一步的深入研究。通过生物信息学软件分析我们发现,除HDAC11外,白细胞介素16(IL-16)可能也是miR-145-3p的一个预测靶基因,而IL-16可以通过多种途径在结核病中发挥重要的免疫调节功能。因此,我们推测:miR-145可能通过调节IL-16的表达而在结核病发病中发挥作用。本文拟通过细胞培养及其体外实验对这一假设进行验证。[方法]1.细胞培养、扩增及诱导分化:采用THP-1细胞系进行持续培养扩增,用含有160nM PMA的含少于5%FBS的RPMI 1640培养基诱导THP-1向巨噬细胞分化。通过细胞形态观察、流式细胞术检测诱导分化细胞的表型。2.IL-16对巨噬细胞增殖、细胞周期、凋亡及吞噬功能的影响:分别用浓度为0 ng/ml(对照组)、10 ng/ml、100 ng/ml、150 ng/ml 的 IL-16 刺激巨噬细胞。分别应用CCK8试剂盒检测不同浓度IL-16刺激对分化后的THP-1细胞增殖的影响;应用流式细胞术检测不同浓度IL-16刺激巨噬细胞后细胞周期、细胞凋亡及的对巨噬细胞吞噬功能的影响。3.miR-145-3p对巨噬细胞增殖、细胞周期、凋亡、及吞噬功能的影响:采用上述实验技术,并通过功能获得(GOF)及功能缺失(LOF)实验研究miR-145-3p过表达和低表达对巨噬细胞的细胞增殖、细胞周期、凋亡的影响。4.miR-145-3p对IL-16的表达水平的影响:采用RT-PCR和Western-blot检测miR-145-3p mimics 及 miR-145-3p inhibitor 对 IL-16 的表达水平的影响。5.应用荧光素梅报告基因从实验角度验证miR-145-3p与IL-16之间是否存在基因-靶基因关系。[结果]1.细胞培养及诱导分化鉴定结果:细胞长势良好,诱导分化后细胞表型CD11阳性。2.IL-16对巨噬细胞增殖、细胞周期、凋亡、及吞噬功能的影响:2.1.CCK-8实验结果:不同浓度的IL-16刺激分化后的THP-1细胞,其细胞增殖情况与正常对照组相比差异无统计学意义。2.2.流式细胞术检测结果:IL-16浓度为0 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、150 ng/ml巨噬细胞处于M期细胞比例分别为5.4%、9.0%、9.3%、9.4%,与对照组相比显示在IL-16刺激下促使分化后THP-1细胞进入分裂期;巨噬细胞凋亡率分别为4.9%、27.6%、33.0%、34.3%,与对照组相比结果显示IL-16可增加巨噬细胞凋亡率,并随着IL-16浓度的升高其凋亡率逐渐升高。2.3.鸡红细胞吞噬实验结果:对照组、吞噬组及实验组吞噬率分别为0%、30%、32%。结果显示IL-16并不影响巨噬细胞的吞噬能力。3.miR-145-3p对巨噬细胞增殖、细胞周期、凋亡功能的影响:3.1.CCK-8实验结果:miR-145-3p mimics组及miR-145-3p inhibitor组巨噬细胞增殖情况与正常对照组相比差异无统计学意义。3.2.流式细胞术检测结果:对照组、miR-145-3p mimics组及miR-145-3p inhibitor组处于M期细胞比例分别为34.8%、46.1%、25.6%;对照组、miR-145-3p mimics组及miR-145-3p inhibitor组凋亡率分别为6.1%、7.4%、4.9%。miR-145-3p过表达后促进巨噬细胞凋亡,而miR-145-3p表达量下降后巨噬细胞的凋亡率降低;4.转染不同浓度miR-145-3p mimics后空白对照组,2.5u1,5u1,10ul组的△△CT值分别为0.64,0.63,0.61,0.66;转染miR-145-3p inhibitor后空白对照组,2.5ul,5ul,l0ul组的 △ △CT值分别为0.66、0.58、0.64、0.65。结果显示IL-16基因的表达量与miR-145-3p无关。Western blot检测结果显示随着转染miR-145-3p mimics浓度的升高IL-16表达量升高,反之IL-16表达量下降。5.荧光素酶报告基因:miR-145-3p与IL-16间无直接基因与靶基因关系。[结论]1、miR-145-3p的表达量升高可增加巨噬细胞的凋亡率,促进巨噬细胞进入M期参与脊柱结核病理过程。但其并不影响巨噬细胞的增殖功能。2、IL-16的浓度升高增加巨噬细胞的凋亡率,促进巨噬细胞进入M期参与脊柱结核病理过程。但其并不影响巨噬细胞的增殖及吞噬功能。3、蛋白表达水平显示miR-145-3p的变化与IL-16的表达变化一致。但miR-145-3p与IL-16间无直接的基因与靶基因关系,miR-145-3p可能通过某一旁路调控IL-16的表达,但该结论有待进一步实验验证。综上所述,miR-145-3p、IL-16的表达通过影响巨噬细胞凋亡及其细胞周期,在结核分枝杆菌(MTB)感染的免疫过程中发挥重要作用。
【图文】：

细胞培养,细胞分化,显微镜下,倍数

图３），细胞培养效果良好

流式细胞术,诱导分化,验标,未分化

符合试验标准逡逑流式细胞仪结果（图４）显示阴性对照组、未分化染色组及诱导分化染色组逡逑的ＣＤｌｌｂ阳性率分别为１．２％，２１．７％，６２．０％。结果显示分化效果较好，符合实逡逑验标准。逡逑未诱导分化未ＣＤｌｌｂ染色逦未诱导分化ＣＤｌｌｂ染色逡逑Ａ０１邋ＴＨＰ－１邋ＮＣ逦Ｆ0２逡逑ｇ邋ＧｉｔｐｏＧＭ逦邋ｓ邋Ｇａ＾ｅ－Ｓｏ邋Ｇａｔｉｎｇ］逡逑＾逦丫邋１２§逦跟％逡逑§＿逦§－逡逑ｌ：；ｊ逦１：：逦１，逡逑°逦ｍ邋丨丨■丨丨⑴丨邋Ｍ邋ｉ邋⑴丨ｌ＿邋Ｉ逦°逦１１邋ｌｌｌｌ邋
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R529.2

【参考文献】