HIPPO信号通路在血吸虫病肝纤维化中的调控机制研究

发布时间：2020-06-05 13:37

【摘要】：目的:血吸虫感染后,虫卵沉积于肝血窦,多种炎性细胞被募集到虫卵周围,参与炎症反应并释放多种细胞因子,这些细胞因子在肝星状细胞活化增殖和肝纤维化发生发展的过程中发挥了重要作用。HIPPO信号通路是由一系列保守的蛋白激酶和转录因子组成的激酶链,与细胞增殖、极化、转分化和凋亡等过程密切相关。HIPPO信号可能通过影响肝非实质细胞的转分化、增殖和凋亡,从而影响肝纤维化的发生和进展,而HIPPO信号通路在血吸虫感染引起的肝脏纤维化发生发展的作用机制尚不清楚。本文拟研究血吸虫感染后宿主肝脏HIPPO通路及其相关蛋白的变化,并通过抑制HIPPO的下游分子YAP(Yes-associated protein,Yes-相关蛋白),来研究HIPPO信号通路对血吸虫感染小鼠肝纤维化进展的影响。方法:雌性8周龄BALB/c小鼠经皮肤感染16条日本血吸虫尾蚴。血吸虫感染4、8和15周后分离小鼠肝星状细胞,检测肝星状细胞HIPPO信号相关分子YAP的表达。在血吸虫感染4周后开始尾静脉注射VP(Verteporfin,维替泊芬),感染8周和10周后观察抑制YAP后小鼠肝脏病变改善情况,并检测肝脏中各促纤维化蛋白及其基因的表达。分离小鼠肝星状细胞,检测病变小鼠原代肝星状细胞纤维化相关分子的表达水平及活化程度改变。为研究HIPPO信号在血吸虫感染后肝巨噬细胞活化中的作用,我们分离了感染及YAP抑制剂干预后的小鼠肝枯否细胞,检测了其活化相关分子的表达,并用感染血吸虫的小鼠枯否细胞的培养上清培养肝星状细胞观察了肝巨噬细胞在体外对星状细胞活化的影响。结果:血吸虫感染6周后小鼠肝脏可见明显的虫卵肉芽肿。血吸虫感染4周、8周和15周后,小鼠肝星状细胞中HIPPO信号相关分子YAP的mRNA表达水平上升,且免疫荧光检测发现YAP蛋白向星状细胞核内聚积。血吸虫感染4周给予VP,可明显改善小鼠肝纤维化程度,肝组织的a-SMA、Collagen-a(16)和TGF-b1表达降低,且肝星状细胞的a-SMA、Collagen-a(16)和CTGF的表达水平也下降了。另外,我们发现YAP抑制剂可下调RAW264.7细胞的Arg1和CTGF的表达。抑制YAP还能使体外培养的原代Kupffer细胞的Arg1、CTGF和TGF-b的mRNA表达水平下降。为明确Kupffer细胞抑制YAP后对肝星状细胞的影响,我们分别用感染小鼠和给予YAP抑制的感染小鼠的Kupffer细胞的上清培养人肝星状细胞系LX-2。结果发现,给予YAP抑制剂能减缓感染小鼠Kupffer细胞上清加剧肝星状细胞活化的过程,表现为肝星状细胞的a-SMA、Collagen1-a(16)和CTGF的表达水平下降。结论:血吸虫感染后肝星状细胞的YAP在转录和翻译水平上调,且向核聚集,说明血吸虫感染后引起的肝纤维化伴随着肝星状细胞中HIPPO通路的抑制和YAP的激活。体内抑制YAP会减轻血吸虫感染小鼠肝纤维化,表明HIPPO通路会影响肝纤维化形成的过程。抑制YAP不仅会抑制肝星状细胞本身的活化,还会抑制Kuppfer细胞趋向M2型极化,使促纤维化因子分泌减少。此外,血吸虫感染小鼠Kupffer细胞能诱导肝星状细胞的活化,而抑制Kupffer细胞的YAP后能缓解这一作用,提示HIPPO通路的激活不仅能直接抑制HSCs的活化,还能影响Kupffer细胞极化,从而影响HSCs的活化间接介导血吸虫肝纤维化的形成。
【图文】：

血吸虫感染,小鼠,吸虫感染,虫卵肉芽肿

图1.血吸虫感染小鼠原代HSCs高表达YAP原代 HSCs 分离自血吸虫感染 4W、8W 和 15W 小鼠。（A）HE 染色和 Masson 染色示日本血吸感染 8 周后小鼠肝脏虫卵肉芽肿。标尺为 200 m。（B）日本血吸虫感染后小鼠的 HSCs，实时定PCR 测量 YAP 的 mRNA。所有数据以均数±标准差表示，n=3（*P㩳0.05）。

日本血吸虫卵,小鼠,日本血吸虫感染,肝组织

图 3. VP 能抑制 YAP 的表达但不影响日本血吸虫卵量日本血吸虫感染 4W 后，每 3 天给小鼠静脉注射 VP，感染后 8W 或 10W 处死小鼠获取肝组织原代 HSCs。（A）单位肝组织重量的血吸虫卵计数代表日本血吸虫感染程度及虫卵沉积程度。数以均数±标准差表示，，n=9（*P㩳0.05）。（B）实时定量 PCR 测量肝组织中 YAP 的 mRNA。数据以数±标准差表示，n=6（*P㩳0.05）。（C,D）免疫荧光染色检测 HSCs 中 YAP 的表达。左：YAP 用 FI抗 YAP 抗体标记，中间：DAPI 染细胞核，右：合并图片。标尺为 10 m。用 ImageJ 软件计算平单个肝星状细胞中总 YAP 和细胞核中 YAP 的积分光密度。所有数据以均数±标准差表示，n=6（㩳0.05）。Fig 3. VPcan inhibit the expression of YAPwithout intervention of parasite burden.BALB/c mice were infected with S. japonicum, four weeks post-infection, mice were treated Verteporfin(VP) or vehicle every three days. Mice were sacrificed to harvest liver tissues and isoprimary HSCs at eight or ten weeks after infection. (A) The egg count per liver weight represented
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2;R532.21

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