成人结核病预防策略的探索性研究

发布时间：2020-06-13 12:25

【摘要】：【背景目的】牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin,BCG)作为目前唯一的预防结核病(TB)疫苗,能够诱导有效的免疫保护儿童抗结核性脑膜炎和粟粒性肺结核等重症结核病,但是BCG提供的保护时间非常短,通常只有10-15年。相应地,BCG免疫缺乏对青少年和成人这一高发人群的免疫保护。青少年和成人仍是TB流行和致死率最高的人群。据世界卫生组织(WHO)估计,2018年世界范围内约有1000万TB新发病例,160万人死于TB,其中90%发生于青少年和成人。而且,世界上约25%的人群属于潜伏结核病感染(Latent tuberculosis infection,LTBI)。因此,如能延长卡介苗免疫的保护期,对防控青少年和成年人TB的发生具有重要意义。巨噬细胞自噬和凋亡,可分别激活抗原递呈的溶酶体途径和交叉递呈途径,也是机体抗结核分枝杆菌感染的重要措施。然而结核分枝杆菌具有多种机制抑制感染细胞自噬和凋亡。在正常生理条件下,虽然BCG具有较弱的诱导感染的巨噬细胞凋亡的能力,但是BCG自身不会诱导感染的巨噬细胞自噬。由于BCG是由具有毒力的牛分枝杆菌通过传代减毒而得到的活疫苗,因此,关键的科学问题是,BCG是否从亲代继承了逃避自噬和凋亡机制而抑制BCG诱导的免疫保护效应。为了分析这些逃避机制对BCG疫苗的早期和长期保护性的影响,在本研究中我们拟从BCG菌株中鉴定抑制自噬基因,基因敲除后评价突变株抗结核分枝杆菌感染的保护性。【方法】1.生物信息学分析:为了找到BCG中抑制巨噬细胞凋亡或自噬的基因,我们运用BLASTn将结核分枝杆菌H37Rv中抑制凋亡和自噬基因nuo G、pkn E和eis与BCG Pasteur 1173P2基因组进行同源比对。将同源比对得到的基因进行分子克隆和测序后,与世界范围内的12株BCG和牛分枝杆菌进行比对和生物信息学分析。2.基因敲除菌株的构建:为了通过增强诱导感染的巨噬细胞自噬或凋亡来增强BCG的有效性,我们在BCG中敲除BCG_3174、BCG_1782和BCG_2432c构建重组BCG并命名为ΔBCG_3174、ΔBCG_1782和ΔBCG_2432c。3.基因敲除菌株诱导自噬和凋亡能力的鉴定:用这些突变BCG菌株以MOI=5感染THP-1巨噬细胞,在感染后不同的时间点检测巨噬细胞凋亡和自噬水平;以及在巨噬细胞内的存活率的变化。分别以野生型BCG(BCG WT)和培养基为对照。4.比较不同突变株免疫小鼠抗结核分枝杆菌感染的保护性:为了分析BCG_3174、BCG_1782和BCG_2432c对BCG疫苗保护性的影响,我们使用C57BL/6小鼠模型来比较ΔBCG_3174、ΔBCG_1782和ΔBCG_2432c抗结核分枝杆菌原发感染的保护性。保护性评价采用肺脏荷菌量和组织病理分析。分别以BCG WT和PBS为对照。5.鉴定BCG_2432c是BCG的抑制自噬基因:使用激光共聚焦检测ΔBCG_2432c和BCG WT感染转染有GFP-RFP-LC3慢病毒的THP-1巨噬细胞后细胞内自噬流的变化;同时使用western-blot检测感染的THP-1巨噬细胞内LC3的变化。以及使用3-MA抑制或雷帕霉素促进自噬评价,并检测在巨噬细胞内的存活率的变化。6.鉴定BCG_2432c抑制自噬的机制:为了检测ΔBCG_2432c诱导巨噬细胞自噬的机制,一方面检测ΔBCG_2432c和BCG WT感染巨噬细胞后胞内活性氧(ROS)的变化,以及评价ROS促进感染细胞的自噬;另一方面,评价感染细胞释放到培养基中的Th1、Th2和Th17型细胞因子随时间的变化。7.评价BCG_2432c对抗原递呈效率的抑制作用:为了分析ΔBCG_2432c诱导自噬对抗原递呈细胞(APCs)抗原递呈能力的影响,我们使用ΔBCG_2432c或BCG WT感染12h后的BALB/c小鼠(H-2d)骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞与Ag85B致敏的CD4+T或CD8+T细胞共孵育24h,通过检测释放到培养基中的IL-2来反应抗原递呈能力的改变。以及使用3-MA抑制自噬评价其自噬特异性介导。8.免疫原性的早期评价:野生型BCG或ΔBCG_2432皮下免疫C57BL/6小鼠,免疫后0-28d的不同时间点,检测脾脏和肺脏的抗原Ag85B特异性T细胞,评价ΔBCG_2432c相对于BCG WT诱导抗原特异性T细胞及多功能T细胞反应的能力以及归巢肺脏的速度。9.评价免疫后诱导的免疫记忆:野生型BCG或ΔBCG_2432皮下免疫C57BL/6小鼠,28d、60d、90d和120d后,检测ΔBCG_2432c相对于BCG WT诱导脾脏和肺脏产生免疫记忆的能力以及归巢速度的变化。10.抗感染的早期和长期保护性评价:野生型BCG或ΔBCG_2432皮下免疫C57BL/6小鼠,14d、28d、60d、90d和120d后,使用小鼠模型分析ΔBCG_2432c相对于BCG WT抗结核分枝杆感染的保护性的改变。11.安全性评价:野生型BCG或ΔBCG_2432经尾静脉感染SCID小鼠,比较幸存率、脾脏和肺脏荷菌量等指标,评价ΔBCG_2432的安全性。【结果】1.BCG_2432c是BCG亚株中一个高度保守的基因:世界范围内的12株BCG基因组中普遍存在结核分枝杆菌H37Rv nuo G、pkn E和eis同源基因BCG_3174、BCG_1782和BCG_2432c,并且高度保守,也在牛分枝杆菌存在。2.突变株成功建立:敲除这些基因的BCG菌株分别命名为ΔBCG_3174、ΔBCG_1782和ΔBCG_2432c,且构建成功。3.ΔBCG_2432c增强感染巨噬细胞的自噬:ΔBCG_1782和ΔBCG_2432c感染的巨噬细胞凋亡水平相对于BCG WT显著增加;BCGWT不能诱导巨噬细胞自噬,而ΔBCG_3174、ΔBCG_1782和ΔBCG_2432c感染的巨噬细胞发生自噬,且ΔBCG_2432c诱导自噬水平最高;ΔBCG_3174和ΔBCG_1782在巨噬细胞内的存活率与BCG WT相比无显著差异,ΔBCG_2432c在巨噬细胞内的存活率显著降低。4.仅ΔBCG_2432c抗结核分枝杆菌原发感染的短期保护性显著强于BCG WT:ΔBCG_3174和ΔBCG_1782免疫C57BL/6小鼠抗结核分枝杆菌原发感染能力与BCG WT相当,而ΔBCG_2432c相对于BCG WT显著降低感染小鼠肺脏荷菌量以及减轻肺部组织病理改变。5.BCG_2432c是BCG的抑制自噬基因:相对于BCG WT和空白对照组,ΔBCG_2432c感染的巨噬细胞内LC3斑点显著增加,且与溶酶体共定位;另外western blot结果显示ΔBCG_2432c感染的巨噬细胞内LC3-I向LC3-II的转变显著增加。ΔBCG_2432c在巨噬细胞内的存活率显著降低;使用雷帕霉素刺激巨噬细胞自噬能够显著降低BCG WT和ΔBCG_2432c在细胞内的存活率;而使用3-MA抑制自噬能够增加ΔBCG_2432c在巨噬细胞内的存活但不能增加BCG WT在胞内的存活率。6.ΔBCG_2432c促进自噬与诱导细胞内活性氧增加有关:ΔBCG_2432c感染的巨噬细胞胞内ROS(H2O2和O2-)水平在感染细胞早期(4h和12h)显著增加;ROS促进了ΔBCG_2432c感染的巨噬细胞的自噬,且在巨噬细胞内的存活率显著降低。另外,ΔBCG_2432c感染的巨噬细胞释放到培养基中的促炎细胞因子TNF-α和IL-6显著增加,其他类型的细胞因子无变化。7.ΔBCG_2432c增强了经自噬溶酶体途径的抗原递呈:ΔBCG_2432c感染小鼠来源的树突状细胞和巨噬细胞与Ag85B致敏的CD4+T细胞共孵育24h后,相对于BCG WT,释放更多的IL-2;使用3-MA抑制树突状细胞和巨噬细胞自噬后再于Ag85B致敏的CD4+T细胞共孵育,IL-2水平显著降低;而3-MA抑制,不改变BCGWT释放IL-2的水平。ΔBCG_2432c或BCG WT感染小鼠来源的树突状细胞和巨噬细胞与Ag85B致敏的CD8+T细胞共孵育后上清中的IL-2水平与对照组相比无显著变化。8.ΔBCG_2432c免疫小鼠,相对于BCG WT,诱导小鼠脾脏产生的Ag85B特异性释放TNF-α、IFN-γ和IL-2的CD4+和CD8+T细胞显著增加,且诱导效应T细胞更早归巢到肺脏。9.相对于BCG WT,ΔBCG_2432c诱导小鼠脾脏和肺脏较早的产生Ag85B特异性分泌IFN-γ的效应免疫记忆细胞(CD62LloCD44hi,TEM)和Ag85B特异性分泌IL-2的中枢免疫记忆细胞(CD62LhiCD44hi,TCM);在免疫后120d小鼠脾脏和肺脏的中枢免疫细胞和效应细胞的水平相当。10.ΔBCG_2432c抗结核分枝杆菌原发感染的能力与免疫后感染时间有关。免疫后28-60d,抗感染能力相对于BCG WT显著增加。11.ΔBCG_2432c感染SCID小鼠后,小鼠肺脏、脾脏和肝脏荷菌量与BCG WT无差别,SCID小鼠存活率与BCG组无差别。【结论】BCG_2432c是BCG的抑制自噬基因,且在世界各地临床应用的BCG亚株中广泛存在;敲除BCG_2432c增强BCG感染的巨噬细胞自噬其促进含菌自噬小体与溶酶体融合,促进抗原递呈而活化CD4+T细胞,促进更多效应T细胞归巢到肺脏;基因敲除BCG_2432c的BCG菌株免疫小鼠的早期清除结核分枝杆菌感染的能力显著增强。【背景和目的】成人是结核病(tuberculosis,TB)流行和致死的主要人群。当前亟待需要研发有效抗成人结核病的疫苗。牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin,BCG)初免异源增强策略已经被广泛的用于抗成人结核病的研究,但是大部分的实验方案并没有比BCG单独免疫相比提高免疫保护性。然而,导致BCG初免异源增强方案失败的原因尚不清楚。在本研究中我们构建融合蛋白CTT3H为基础的重组腺病毒疫苗(r Ad CTT3H),CTT3H蛋白结合DMT佐剂疫苗(CTT3H-DMT)和DNA结合DMT佐剂疫苗(p CTT3H-DMT);然后使用C57BL/6小鼠模型比较CTT3H为基础的疫苗与BCG抗结核分枝杆菌感染保护性的差异;并比较BCG初免CTT3H为基础的疫苗增强抗早期感染和持续性感染产生的免疫原性和免疫保护性。【方法】1.CTT3H为基础的疫苗构建:构建并验证融合蛋白CTT3H为基础的重组腺病毒疫苗(r Ad CTT3H)和DNA结合DMT佐剂疫苗(p CTT3H-DMT)。2.CTT3H为基础的疫苗抗结核分枝杆菌原发感染保护性评价:使用C57BL/6小鼠模型比较CTT3H为基础的疫苗与BCG抗结核分枝杆菌早期原发感染保护性的差异:小鼠免疫BCG或CTT3H为基础的疫苗9周后使用结核分枝杆菌标准株H37Rv滴鼻感染,4周后处死小鼠进行脾脏和肺脏菌落计数以及肺部组织病理分析以评价保护性。3.BCG初免-CTT3H为基础的疫苗增强抗结核分枝杆菌早期原发感染保护性评价:使用C57BL/6小鼠模型比较BCG初免CTT3H为基础的疫苗增强策略抗早期原发感染保护性:小鼠免疫BCG 8周后使用CTT3H为基础的疫苗或BCG增强,BCG初免17周后使用结核分枝杆菌标准株H37Rv滴鼻感染,感染4周后处死小鼠进行脾脏和肺脏菌落计数以及肺部组织病理分析以评价保护性。4.BCG初免-CTT3H为基础的疫苗增强抗结核分枝杆菌晚期持续性感染保护性评价:使用C57BL/6小鼠模型比较BCG初免CTT3H为基础的疫苗增强策略抗持续感染保护性:小鼠免疫BCG 4周后使用结核分枝杆菌标准株H37Rv滴鼻感染,感染4周后使用CTT3H为基础的疫苗或BCG增强,BCG初免19周后使用结核分枝杆菌标准株H37Rv滴鼻感染,感染4周后处死小鼠进行脾脏和肺脏菌落计数以及肺部组织病理分析以评价保护性。5.CTT3H为基础的疫苗免疫原性分析:使用C57BL/6小鼠模型比较CTT3H为基础的疫苗与BCG抗结核分枝杆菌早期原发感染的免疫原性分析。小鼠免疫BCG或CTT3H为基础的疫苗9周后,检测外周血中抗体Ig G、Ig G1和Ig G2a滴度以及脾细胞释放IFN-γ和疫苗产生的CTL效应。6.BCG初免-CTT3H为基础的疫苗增强后抗早期原发感染的免疫原性分析:使用C57BL/6小鼠模型比较BCG初免CTT3H为基础的疫苗增强策略抗早期原发感染的免疫原性。小鼠免疫BCG 8周后使用CTT3H为基础的疫苗或BCG增强,BCG初免17周后,检测外周血中抗体Ig G、Ig G1和Ig G2a滴度以及脾细胞释放IFN-γ和疫苗产生的CTL效应;使用流式细胞术检测脾脏和肺脏中抗原CTT3H特异性的分泌IFN-γ或IL-2的CD4+或CD8+T细胞和CTT3H特异性的分泌IFN-γ的效应记忆T细胞(CD62LloCD44hi,TEM)和中枢记忆T细胞(CD62LhiCD44hi,TCM)。7.BCG初免CTT3H为基础的疫苗增强策略抗晚期持续感染的免疫原性:小鼠免疫BCG 4周后使用结核分枝杆菌标准株H37Rv滴鼻感染,感染4周后使用CTT3H为基础的疫苗或BCG增强,BCG初免19周后处死小鼠,使用流式细胞术检测脾脏和肺脏中抗原CTT3H特异性的分泌IFN-γ或IL-2的CD4+或CD8+T细胞和CTT3H特异性的分泌IFN-γ的效应记忆T细胞(CD62LloCD44hi,TEM)和中枢记忆T细胞(CD62LhiCD44hi,TCM)。【结果】1.CTT3H为基础的重组腺病毒疫苗(r Ad CTT3H)和DNA结合DMT佐剂疫苗(p CTT3H-DMT)构建成功。2.CTT3H为基础的疫苗诱导的抗结核分枝杆菌早期原发感染的保护性相当,但不及BCG诱导产生的免疫保护。3.CTT3H为基础的所有种类疫苗均不能有效的增强BCG抗结核分枝杆菌早期原发感染。4.CTT3H为基础的所有种类疫苗均显著增强BCG抗结核分枝杆菌持续性感染,且与疫苗类型无关。5.CTT3H为基础的疫苗诱导产生Th1型免疫反应,其中r Ad CTT3H免疫组小鼠外周血中Ig G2a/Ig G1比值和脾细胞产生INF-γ最高,p CTT3H-DMT免疫小鼠产生的CTL效应最强。6.CTT3H为基础的疫苗暴露前增强BCG产生强烈的Th1型免疫反应,其中BCG初免r Ad CTT3H增强组鼠Ig G2a/Ig G1比值和脾细胞产生INF-γ最高,所有同源增强组和异源增强组产生的CTL效应均高于BCG初免PBS增强对照组;CTT3H为基础的疫苗暴露前增强BCG诱导产生更多的CTT3H特异性的分泌IFN-γ的效应T细胞和TEM,但是分泌IL-2的效应T细胞和TCM没有增加。7.CTT3H为基础的疫苗暴露后增强BCG均产生更多的CTT3H特异性的分泌IFN-γ的效应T细胞和TEM细胞以及分泌IL-2的效应T细胞和TCM细胞,与疫苗类型无关。【结论】BCG初免增强策略更适合于抗结核分枝杆菌晚期持续性感染。暴露后增强BCG诱导产生更多的IFN-γ+TEM和IL-2+TCM细胞与提高抗结核分枝杆菌晚期持续性感染的保护性密切相关,这些生物学标志可为进入临床研究的疫苗筛选提供参考,并给未来抗成人结核病疫苗的研发提供帮助。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R52

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