中缅边境流行区间日疟原虫感染人群的T细胞及其相关趋化因子的测定

发布时间：2020-06-13 16:26

【摘要】：目的:作为一个世界范围内的公共卫生问题,疟疾是由来源于疟原虫引发的虫媒传染性疾病。根据2018世界卫生组织的疟疾报告,2017年估计有2.19亿例疟疾感染患者及大约43.5万人死亡。其中,间日疟分布广泛,主要在亚洲和太平洋地区流行。我国疟疾主要以间日疟感染为主。近年来,由于中央和地方各级政府对疟疾防控工作的支持和投入,一些地区的疟疾流行已得到了有效遏制,但在疟疾高发的边境地区,其疟疾的流行直接影响到我国疟疾的发生。我国本土疟疾已经基本消除,疟疾患者主要来源于输入性疟疾感染,其中中缅边境地区输入性间日疟感染占总数的73.4%。因此,控制和消灭疟疾仍然是我国与国际社会的共同目标。抗疟免疫机制的解析是研发有效疫苗、制定疟疾防控策略的前提。研究表明,在很大程度上,保护性疟疾免疫与T细胞免疫应答密切相关。我们以前的研究结果显示,在疟原虫感染的红内期阶段,CD4~+T细胞发挥关键的抗疟保护作用。其中CD4~+Th1细胞可以通过分泌IFN-γ来抑制初次侵入的疟原虫的快速增殖,而CD4~+Th2细胞则在疟疾感染后期通过辅助相应B细胞产生相应的特异性抗体,有效地消灭疟原虫,以此阻止这种疾病的复发与再燃。CD8~+T细胞被认为是抗肝期疟原虫感染的重要细胞,实验模型的研究表明这些细胞直接促进感染肝细胞的裂解和疟原虫的死亡,这些事件是由IFN-γ,穿孔素和颗粒酶B调节的。疟原虫进入机体后产生由众多免疫细胞参与的免疫应答,而趋化因子对这些免疫细胞的迁移与调节相应的免疫功能具有非常重要的作用。趋化因子超家族是一类在炎症或病理条件下,诱导粒细胞沿其浓度梯度迁移运动的可溶性蛋白分子。它们通常是大约8-14kDa的低分子多肽,通过七个跨膜G蛋白偶联受体(GPCRs)传递信号;根据N末端附近保守的半胱氨酸残基相对位置的不同,趋化因子可分为CC、CXC、CX3C和C亚族。大量科学研究发现,在疟原虫侵入人体后,趋化因子对疟疾形成与抑制发挥着重要的生物学作用。疟原虫感染可促发不同趋化因子的水平变化。有资料显示,CXCR3的配体趋化因子CXCL9与CXCL10在伯氏疟原虫感染鼠的脑中高度表达。与野生型小鼠相比,CXCR3缺陷小鼠在脑疟中具有明显的保护作用,且脑内T细胞明显减少。疟疾感染人群中也伴有不同程度趋化因子水平的变化。2015年,我们在云南与缅甸边境进行了疟疾的流行病学调查,并采集了当地疫区人群的单核细胞和血浆样本,检测T细胞亚群的比例与血浆中T细胞应答相关的趋化因子的表达水平,利用统计学方法来分析各项检测指标与患者基本信息的相关性以及各T细胞亚群与相关的趋化因子之间的内在联系,为防控间日疟提供相应线索。研究方法:2015年,我们在云南与缅甸边境进行了疟疾的流行病学调查。(1)样本收集:在符合医学伦理的前提下,并且获得参与者的知情同意后,记录他们的基本信息,由医学相关专业人员采集相关的血液样本,并制备相应的血涂片,在显微镜下确定疟原虫感染类型和对应的感染率。共采集患者血浆54份,淋巴细胞36份,及正常对照血浆22份。(2)实验分组:流行区正常对照组:22例症状性P.v感染患者:54例(3)使用悬液芯片技术测定血浆样本中趋化因子的表达:根据说明书要求,将含有不同检测指标抗体的磁珠加入到96孔板中,清洗后,将4倍稀释的血浆样本和标准品加入每个孔中,避光封闭,振荡温育1小时;孵育后,用洗涤液洗涤板三次,在每个孔中加入检测抗体,避光振荡孵育30分钟;再次用洗涤液洗涤板后,向每个孔中加入PE染液,避光振荡15分钟后。向每个孔中加入125μl测定缓冲液,震荡30秒,然后上机检测。(4)流式细胞仪检测淋巴细胞中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞亚群比例:常规细胞复苏后,取1×10~6/ml淋巴细胞悬液0.1ml,PBS洗涤后,加入抗人CD4和CD8的荧光抗体孵育30 min,PBS洗涤后,通过流式细胞仪检测细胞亚群比例。统计学分析:测得实验数据由Bioplex Manager(Bio-Rad Version 4.0)软件处理,并根据绘制的标准曲线换算得到各检测指标的浓度值。样本数据用统计软件SPSS22.0和GraphPad prism 5进行相应的统计学分析。采用的统计方法中,两组数据的中位数比较用Mann-Whitney U检验,同时采用Spearman相关性分析进一步分析各趋化因子与患者基本资料之间的相关性。p0.05具有统计学意义。结果:1.在间日疟急性感染期,T细胞应答相关的趋化因子CXCL9,CXCL10,CXCL11,CXCL13,CCL13和CCL1的水平均显著升高。2.Th1型细胞趋化因子CXCL10和Th2型趋化因子CXCL13的表达水平与间日疟感染患者的年龄呈正相关。3.Th1型细胞趋化因子CXCL10对CD4~+T细胞的募集可能起到关键的调控作用。结论:在中缅边境疟疾流行区,通过检测间日疟原虫感染血液T细胞亚群分布以及T细胞应答相关的趋化因子的表达水平发现,T细胞应答相关的趋化因子CXCL9,CXCL10,CXCL11,CXCL13,CCL13和CCL1可作为间日疟原虫感染急性期的敏感性生物指标,用于诊断早期疟疾感染。Th1型细胞趋化因子CXCL10对CD4~+T细胞的募集起到关键性的调控作用,以CXCL10为靶点,为疟疾免疫干预策略的确立提供新的实验依据。
【图文】：

趋化因子,表达水平,血浆,患者

A-F 依次为血浆中趋化因子 CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL13，CCL13 和 CCL1 的表达水平，数据用中位数和四分位数表示，采用 Mann Whitney U 检验。 *: p<0.05, **: p<0.01, ***:p<0.0013.3 间日疟原虫感染患者血浆 T 细胞相关的趋化因子水平与年龄的相关性为探讨患者自身状态对血浆中上述趋化因子表达水平的影响，我们进一步分析间日疟感染患者的血浆中趋化因子表达水平与患者年龄的相关性，Spearman 分析结果显示，Th1/CD8+T 细胞的趋化因子 CXCL9，CXCL10 和 CXCL11 以及 Th2 型 T细胞趋化因子 CXCL13 的表达水平与患者的年龄呈一定正相关趋势，，但只有趋化因子 CXCL10（图 2B）和 CXCL13（图 2D）的相关性具有统计学差异（图 2）。

趋化因子,中缅边境,地区间,年龄

图 2 中缅边境地区间日疟感染患者血浆趋化因子水平与年龄的相关性A-F 依次为血浆中趋化因子 CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL13，CCL13 和 CCL1 的表达水平与患者年龄的相关性，懫用 Spearman 进行相关性分析。 *: p<0.05, **: p<0.013.4 不同性别的间日疟原虫感染患者血浆 T 细胞相关的趋化因子水平比较分析不同性别对间日疟感染患者血浆上述趋化因子表达水平的影响，我们比较了男女患者的血浆趋化因子的表达水平。结果显示，男性患者和女性患者血浆中的趋化因子 CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL13，CCL13 和 CCL1 的表达水平均无显著性差别（p>0.05），提示性别对趋化因子的表达无明显影响(图 3)。ABC
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R531.3

【相似文献】