SPT20基因在白念珠菌抗氧化损伤机制中的功能研究

发布时间：2020-06-16 16:43

【摘要】：背景:白念珠菌是人类真菌感染中最突出的真菌病原体,其致病率日渐升高而目前抗真菌治疗手段却不尽人意。因此有必要进一步研究白念珠菌的致病机制,寻找新的药物作用靶点。课题组首次报道SPT20基因是白念珠菌重要的毒力基因,其可通过多种途径调控白念珠菌的活力与毒力。目前罕有对白念珠菌SPT20的研究,其毒力对应的分子机制尚不清楚。但已有报道抗氧化损伤能力是白念珠菌毒力的重要体现,因此有必要评估SPT20基因在白念珠菌抗氧化损伤机制中的作用。目的:本研究拟通过基因、蛋白水平探讨SPT20基因在白念珠菌抗氧化损伤系统中的作用,进一步揭示其发挥作用的潜在分子机制。方法:我们在含有H202的YPD培养板上观察了白念珠菌野生株,SPT20缺失株和SPT20回复株的生长情况。然后利用DCFH-DA检测了有/无H202刺激下白念珠菌细胞内ROS的水平,并用试剂盒评估关键抗氧化酶的活性以及不同菌株细胞内[GSH/GSSG]比率。此外,通过RT-PCR评估白念珠菌STP20缺失株中氧化应答关键基因的转录情况,并且使用蛋白质印迹试验阐明Hogl的磷酸化水平。结果:连续梯度稀释试验提示,SPT20的缺失导致白念珠菌对外源性氧化剂H202的敏感性升高。与野生型菌株相比,SPT20缺失株菌体内ROS水平明显升高,而对清除ROS有关键作用的CAT活性明显降低。同时,体现白念珠菌氧化应激压力[GSH]/[GSSG]比率明显升高,SPT20缺失株面临更高的氧化损伤压力。RT-PCR结果显示,SPT20的缺失导致氧化应答相关基因(包括CAT1,和GLR1)的表达水平发生变化,且与上述结果相符合。蛋白质印迹分析进一步显示,SPT20的缺失显着增强了Hog1的磷酸化水平,说明其对白念珠菌调控氧化应答关键通路(Hog1-MAPK通路)产生了重要影响。结论:SPT20基因在白念珠菌氧化应答过程中发挥了关键作用,其对白念珠菌抗氧化酶系统、谷胱甘肽系统发挥正常功能是必需的,并且可能参与氧化应答相关通路的过程,为临床抗真菌治疗提供了潜在的靶点。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R519.3
【图文】：

通过连续稀释点板的方法，将白念珠菌、缺失株、？ＳＰＤＯ回复株在含不同逡逑浓度Ｈ２０２邋ＹＰＤ培养板上生长，３０°Ｃ培养４８ｈ后，观察菌株的生长情况，实验逡逑结果如图３－１所示。逡逑１０＊邋１０：邋１０２邋１０１邋１０邋‘邋１０３邋１０２邋１０１邋１０４邋１０３邋１０２邋１０１邋１０４邋１０３邋１０２邋１０１邋１０‘邋１０３邋１０２邋１０１逡逑ｓｐｔ２０Ａ／Ａ逡逑３ｔｐ２0Ａ／ＳＰＴ２０逦ｊ逡逑ＹＰＤ逦２ｍＭ邋１＾０２逦４ｍＭ邋Ｈ２0２逦６ｍＭ邋Ｈ２0２逦８ｍＭ邋明逡逑图３－１邋５７Ｔ２０基因缺失后白念珠菌对Ｈ２０２敏感性增高，且随Ｈ２（）２浓度增加而增高。ＳＰ７７０逡逑基因的引入可逆转白念珠菌对ｈ２ｏ２的高敏感性。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．邋３－１邋Ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋0＼＇ＳＰＴ２０邋ｇｅｎｅ邋ｌｅａｄｓ邋ｔｏ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋Ｃａｎｄｉｄａ邋ａｌｂｉｃａｎｓ邋ｔｏ邋Ｈ２0２－逡逑Ｔｈｅ邋ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｉ＇邋ＳＰＴ２０邋ｇｅｎｅ邋ｃａｎ邋ｒｅｖｅｒｓｅ邋ｔｈｅ邋ｈｉｇｈ邋ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋Ｃａｎｄｉｄａ邋ａｌｂｉｃａｎｓ邋ｔｏ邋Ｈ２0２－逡逑由连续稀释点板试验结果可以看到，缺失]株／ｌ：邋ＹＰＤ培养板上１ｄ现逡逑与白念珠南野生株类似的生长状况，可知敲除后＋会影响白念珠菌生长逡逑状况ｕ邋ｌ〖ｌＭ丨对环境屮Ｈ２０２压力T，缺失株的抵抗能力相比野生株明显减逡逑弱，回复ＳＰ：Ｔ２（；基因后T逆转这种情况。说明缺失基因的白念珠菌对Ｈ２０２逡逑的敏感性明显增高，其抗氧化损伤能力明显减弱。逡逑３．２邋５７７＾基因缺失株细胞内ＲＯＳ含量明显上升逡逑作为自由基产生物

ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ＳＰＴ２０邋ｄｅｌｅｔｉｏｎ邋ｓｔｒａｉｎ邋ｗａｓ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．逡逑我们通过检测刺激组（６ｍＭ邋Ｈ２０２）和非刺激组４８小时内细胞中荧光强度逡逑的变化情况，比较了不同菌株细胞内ＲＯＳ积累情况。结果如图３－２所示。结果逡逑３４逡逑

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本文编号：2716298