MiR-15b上调Treg细胞生成、增加IL-10表达抑制新生隐球菌肺炎炎性反应机制的研究

发布时间：2020-06-17 07:15

【摘要】：隐球菌是一种临床上十分重要、且感染后较难治疗的致病真菌,几乎全部经过肺部入侵而感染人体。隐球菌侵入呼吸道系统后,一般情况会被上皮细胞、巨噬细胞等吞噬,临床上仅表现为咳嗽、低热、呼吸音减弱等症状体征。但如果隐球菌逃避了宿主自身免疫反应,也可侵犯到其他系统,如神经系统、骨骼系统,皮肤及内脏系统,其中以侵犯神经系统愈后最差,致死率高。人类致病隐球菌主要有新生隐球菌和格特隐球菌,其中新生隐球菌感染多发生于免疫力低下的人群,如白血病、淋巴瘤、长期应用糖皮质激素等。近些年随着HIV感染率的增加和器官移植患者的增加,隐球菌感染率也越来越高。这都说明在隐球菌感染人体过程中,宿主的免疫系统调节能力发挥了至关重要的作用。隐球菌入侵人体后,同时激活人体天然免疫和获得性免疫系统,天然免疫是第一道屏障,效应分子主要有补体系统,溶菌酶,细胞因子和一定效应细胞。获得性免疫针对性更强,可粗略的分为体液免疫和细胞免疫。无论是天然免疫还是获得性免疫,都受到体内大环境的调节。MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,其在细胞内具有多种重要的调节作用,特别是在免疫系统中发挥的作用,近年来多有报道,比如国外研究发现miR-15b能够上调调节性T细胞的表达,从而调控体内免疫反应。调节性T细胞(Regulatory cells,简称Tregs)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群,在天然免疫和适应性免疫系统中发挥着重要的作用。调节性T细胞可分为天然产生的自然调节性T细胞(nTreg)和诱导产生的适应性调节性T细胞(aT-reg或iTreg),Treg细胞的异常表达与自身免疫性疾病有着密切的关系。调节性T细胞主要通过IL-10和TGF-β发挥免疫抑制作用。近年来人们对白细胞介素-10和转化生长因子-β在变态反应免疫抑制中的作用进行了较为详细的研究,从结果来看,几乎所有单核巨噬细胞都是IL-10抑制性作用的靶细胞。所以本研究拟在前期实验基础上通过肺隐球菌小鼠模型,检测miR-15b、Treg细胞及IL-10的表达规律,初步探讨宿主感染隐球菌后的体内免疫反应机制,寻找可能的治疗靶点。研究方法:第一部分,已有报道表明隐球菌诱导THP-1细胞后miR-15b异常表达,我们先将隐球菌与THP-1细胞共培养,分别设立0 h、3 h、6 h、9 h、12 h时间点,再次通过聚合酶链式反应测得miR-15b表达规律,以检验之前结果的正确性。之后塑造隐球菌肺炎小鼠模型,于感染后1 d、4 d、7 d、11 d、14 d、17 d时间段测得肺隐球菌小鼠外周血中miR-15b表达规律,流式细胞仪检测技术检测了小鼠外周血中Treg细胞所占比例,通ELISA测得感染小鼠外周血IL-10、TNF-α表达规律。同时我们将小鼠双肺做切片并嗜银染色,观察隐球菌在小鼠肺内感染情况。第二部分,予尾静脉注射miR-15bmimics,通过聚合酶链式反应测得miR-15b表达规律,流式细胞仪检测技术检测了小鼠外周血中Treg细胞所占比例,通ELISA测得感染小鼠外周血IL-10表达规律。第三部分,予小鼠尾静脉注射miR-15inhibits,之后塑造隐球菌肺炎小鼠模型,于感染后第7 d测得肺隐球菌小鼠外周血中miR-15b表达规律,感染后第11 d流式细胞仪检测技术检测了小鼠外周血中Treg细胞所占比例,通ELISA测得感染小鼠外周血IL-10、TNF-α表达规律。同时我们将小鼠双肺做切片并嗜银染色,观察隐球菌在小鼠肺内感染情况。结果:第一部分:将隐球菌与THP1细胞共培养,测得miR-15b表达呈现先缓慢上升,再下降的规律。隐球菌小鼠肺炎模型小鼠外周血中miR-15b表达规律同细胞实验,约在第7天达到高峰,后逐渐降低。流式细胞技术测得Treg细胞表达规律、ELISA测得IL-10表达趋势同miR-15b的变化趋势。小鼠肺组织切片嗜银染色提示隐球菌在小鼠肺内增殖。第二部分:尾静脉注射miR-15bmimics,7天后测得小鼠外周血中miR-15b表达明显升高,流式细胞技术测得Treg比例增高,ELISA测得IL-10表达增加。第三部分:予小鼠尾静脉注射miR-15inhibits后,隐球菌感染小鼠,7天后小鼠外周血中miR-15b表达较未注射miR-15inhibits组(对照组)明显降低,11天后,流式细胞技术测得Treg比例,ELISA测得IL-10表达均较对照组低,而TNF-α表达较对照组高。小鼠肺组织切片嗜银染色提示隐球菌数量较对照组明显减少。结论:隐球菌感染小鼠后,能够刺激小鼠体内miR-15b高表达,而miR-15b可上调Treg细胞生成,进一步促进IL-10的表达,从而抑制TNF-α等细胞因子机体防护作用的发挥,即对隐球菌的清除作用降低,导致隐球菌在宿主体内繁殖。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R519
【图文】：

图 1.1 新生隐球菌诱导 THP1 细胞，miR-15b 表达规律）新生隐球菌感染小鼠外周血 miR-15b 表达规律用新生隐球菌 H99 感染小鼠，提取外周血 RNA 后，采用 Q-PCR 技中miR-15b的表达规律。如图 1.2所示，肺隐球菌感染小鼠外周血中 慢，后快速增长，并在大约第 7 天达到峰值，后逐渐下降。

图 1.1 新生隐球菌诱导 THP1 细胞，miR-15b 表达规律）新生隐球菌感染小鼠外周血 miR-15b 表达规律新生隐球菌 H99 感染小鼠，提取外周血 RNA 后，采用 Q-PCR miR-15b的表达规律。如图 1.2所示，肺隐球菌感染小鼠外周血中，后快速增长，并在大约第 7 天达到峰值，后逐渐下降。

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本文编号：2717268