乙肝肝硬化的肠道微环境及菌群代谢网络分析

发布时间：2020-06-17 09:23

【摘要】：人体是一个超个体,其疾病或健康状态受到基因与外界环境的双重影响,而基因既包括人体自身基因,也包括人体内寄居的微生物基因。人体自身微生物广泛参与机体的功能调节及共代谢,菌群的结构组成以及功能代谢密切影响人体的生理状态。人体自身微生物主要来源于人体胃肠道(29%),其次为口腔(26%)和皮肤(21%)。“人类肠道宏基因组计划”进行了一项规模最大的肠道菌群基因组研究,构建了一个非冗余的4.2M人体肠道微生物基因集参考目录,为我们进行肠道菌群的研究提供了很好的数据平台。肠道微生物菌群是一个可以调节的、与人类健康息息相关的重要内分泌器官,数以万亿的肠道微生物为宿主贡献了大量的基因资源。肠道菌群被誉为人体的“第二大基因组”,与肝硬化、肥胖、糖尿病、肠炎等多种疾病具有密切的关系。我国包括东南亚和非洲等一些国家属于HBV高流行区,大于8%的人群有慢性HBV感染。慢性感染的成年人中,20%-30%会发展为肝硬化和/或肝癌。在我国,肝硬化患者中血清HBV DNA阳性率高达76.7%。据世界卫生组织报道,2015年,乙型肝炎导致88.7万人死亡,大多死于肝硬化和肝细胞癌。肝脏参与了机体各种物质的代谢过程,因此,肝脏病变必然导致机体其它器官的病理改变。可见,肝病是全身系统疾病,需要应用系统生物学观点,从整体层面上了解生物体系各个系统的功能。本实验室前期对乙肝肝硬化患者的肠道菌群宏基因组进行了高通量测序及生物信息分析,确定了乙肝肝硬化相关的肠道菌群结构特点,然而,对于功能代谢的研究仅仅是停留在基因水平的预测,没有明确的数据支持。“组学”数据分析是一个快速发展的领域,“组学”技术中的最新进展已经为生物学研究创造了空前的机会。本课题首次将宏基因组学、宏蛋白质组学和宏代谢组学的研究相结合,分析乙肝肝硬化患者肠道菌群的结构及功能特点。根据CTP评分标准,本研究分别选取A、B、C三级的患者作为病例组,选取健康成年人作为对照组。首先,采集研究对象新鲜的粪便样品,提取宏蛋白质组样本,进行LC-MS/MS质谱检测,并与数据库进行比对,得到蛋白质的定性定量信息,构建乙肝肝硬化相关的肠道菌群宏蛋白质组数据库,以及疾病相关的菌群差异功能蛋白及其变化规律。为进一步验证肠道菌群功能蛋白的作用结果,本研究进一步选取研究对象,提取其粪便样品中的宏基因组DNA及代谢产物,分别进行高通量Miseq测序及HPLC-GC/MS-MS检测,进行肠道菌群结构及代谢产物的鉴定及数据分析,确定乙肝肝硬化相关的肠道菌群代谢产物的差异,及其与肠道菌群结构的关系。最终结合临床症状及组学分析,全面阐述乙肝肝硬化相关的肠道菌群微环境特点,并构建疾病相关的肠道微生态代谢网络图谱。本研究粪便样品的宏蛋白质组测序原始数据已经上传至iprox公共数据库。本研究共检测到5,020个蛋白,88%来源于细菌,12%来源于人自身。患者比正常人检测得到更多的蛋白质个数,尤其是B、C级患者,检测得到蛋白质的个数为正常人的两倍。对所有蛋白质进行功能和代谢注释,发现患者比正常人注释得到更多的GO类别和KEGG类别,因此我们推测,随着疾病进展,肝硬化导致的肠道微环境改变,迫使肠道菌群增强其生长代谢活性及蛋白表达,从而能得以生存。本研究确定了肝硬化相关的肠道菌群中心宏蛋白质组,包括119个蛋白,其中27%的蛋白参与碳水化合物及氨基酸的转运代谢功能,说明肝硬化相关的肠道菌群具有较高的代谢活性。本研究筛选出ABC三级患者共有的高表达蛋白,共得到14个蛋白,涉及到11个代谢通路,其中9个通路涉及碳水化合物和氨基酸相关代谢。在两个代谢通路中,患者特有蛋白的数量随着病情加重而增加,在C级患者中,特有蛋白几乎覆盖了整个代谢通路,这两个代谢通路分别是:缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成;泛酸盐和辅酶A的生物合成。另外,我们对肝硬化患者及正常人的粪便样品进行了宏基因组学及宏代谢组学分析。研究显示,肝硬化患者的粪便样品显著缺失拟杆菌科,同时肠杆菌科,韦荣球菌科,链球菌科的丰度显著增加。代谢组学结果共检测到108种代谢产物,其中26种代谢产物的丰度在患者及正常人之间具有显著差异。这26种代谢产物涉及到5个类别,分别是胺,不饱和脂肪酸,短链脂肪酸,氨基酸和糖醇。同时,肝硬化患者的肠道微生物群-代谢相关性发生改变。肝硬化样本中尸胺的丰度显著增加,并与梭状杆菌的丰度呈正相关。4-羟基丁酸盐与酸杆菌门,纤维杆菌门,迷踪菌门和螺旋菌门呈显著正相关。琥珀酸与放线菌门呈显著正相关。己酸和庚酸与柔膜菌门呈显著相关。我们将本研究有意义的功能蛋白及代谢产物还原到原始的KEGG代谢通路中,共得到7个代谢通路在患者中显著增强,分别是:(1)氮代谢;(2)丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢;(3)缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成;(4)泛酸盐和辅酶A生物合成;(5)糖酵解/糖异生;(6)果糖和甘露糖代谢;(7)精氨酸和脯氨酸代谢。根据以上研究结果,绘制了乙肝肝硬化相关的肠道菌群代谢网络:肝硬化患者肠道中谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶的高水平表达,直接导致代谢产物谷氨酸的水平升高,谷氨酸盐会进一步参与氮代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等通路。精氨酸和脯氨酸代谢水平的增强,导致代谢产物中脯氨酸和腐胺水平的增加,进一步降解产生更多的胺,氮代谢增强也会产生更多的胺。果糖和甘露糖代谢水平增强,导致代谢产物中甘露醇和山梨醇的丰度增加,这两种代谢产物进一步参与氨基糖和核苷糖代谢途径。缬氨酸和异亮氨酸的生物合成增加,同时,糖酵解/糖异生代谢通路增强,导致产生更多的丙酮酸,进入泛酸盐和辅酶A生物合成通路,也会产生较多的缬氨酸。缬氨酸和异亮氨酸的降解产生较多的胺。本研究是首次乙肝肝硬化相关的肠道菌群多组学研究,提出了乙肝肝硬化相关的肠道微生物中心宏蛋白质组的存在,并揭示了肝硬化相关的肠道微生物代谢网络。肠道菌群的异常代谢以及肠道来源的胺的积累会增加患者并发肝性脑病的风险。基于本研究构建的乙肝肝硬化相关的肠道微生物代谢网络图谱,临床上,调节患者肠道菌群结构及代谢(如氨基酸的代谢),降低胺的产生,从而改善患者肠道微环境,对于改善患者的预后具有一定的指导意义。人类肝脏与肠道微生态菌群存在恒久而重要的共生关系,从而进一步影响人体健康。长期连续监测肠道菌群结构的变化,实现疾病的早期预测,可以为疾病的肠道微生态治疗提供理论依据。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62;R575.2
【图文】：

曲线,定量标准,蛋白质组,军事科学院

A组宏蛋白质组提取定量标准曲线

蛋白质组,定量标准,准曲线,名称

A组宏蛋白质组SDS-PAGE检测胶图

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