HBV-DNA聚合酶对肝癌细胞恶性行为的调控及机制研究

发布时间：2020-06-18 21:14

【摘要】：【目的】Hepatitis B Virus(HBV)感染是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)发生中最常见的原因,HBV基因组有4个开放读码框,其中P基因区是最大的一个开放读码框,目前已有研究发现HBV-DNA聚合酶,(HBV-DNAP)通过基因突变从而达到免疫逃避及耐药性的效果,但其对宿主基因的作用机制尚不太清楚,因此本文主要来研究HBV-DNA聚合酶对肝癌细胞的功能学机制的影响。并且借助RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验,通过深度测序找到了其特异性结合的mRNA,并且阐明了HBV-DNAP在肝癌发生中的作用机制。【方法】首先在肝癌细胞系Huh7和HepG2细胞中过表达HBV-DNAP基因,然后通过MTT实验、平板克隆实验、Transwell迁移以及侵袭实验表明了HBV-DNAP对肝癌细胞的活性、增殖、迁移及侵袭能力都具有促进作用。为了进一步研究其如何来实现以上功能,我们通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验,进行RIP-seq测序,然后将沉淀下来的复合物中的RNA进行分离、纯化。然后由北京诺禾致源公司进行深度测序,从而比较与HBV-DNAP特异性结合的mRNA表达丰度,并根据其提供的GO注释等对其功能的阐述,然后先筛选了5个与HBV聚合酶P特异性结合的基因,,然后构建了它们的过表达质粒,将其构建在带有Flag和Myc标签的载体上。然后通过Western blotting实验用外源性抗体检测发现HBV聚合酶P只对Von Hippel-Lindau(VHL)基因有明显影响,因此进一步通过RT-qPCR实验和Western blotting实验从转录和翻译水平证明了HBV-DNAP能够下调VHL的表达,并且还通过加入放线菌素D来检测HBV-DNAP对VHL mRNA稳定性的影响,从而证明其通过降解VHL mRNA水平从而下调了VHL的水平,我们又进一步探究了VHL对肝癌细胞的生物学功能的影响,表明VHL能够抑制对肝癌细胞活性、增殖、迁移以及侵袭能力的影响,因此,为明确HBV-DNAP是否通过VHL来实现其促进肝癌细胞恶性行为的功能,因此又通过挽救实验证明HBV-DNAP可通过VHL来发挥其对肝癌细胞活性、增殖、迁移以及侵袭能力的促进作用。【结果】在Huh7和HepG2肝癌细胞中通过细胞功能学实验表明HBV-DNAP能够促进肝癌细胞的生长、迁移、侵袭能力以及EMT进程,然后通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验,将沉淀的RNA进一步通过RIP-seq测序,综合其提供的GO注释及KEGG分析寻找到了与HBV-DNAP特异性结合的mRNA,通过外源性检测HBV-DNAP对筛选基因蛋白水平是否有影响,从而确定了特异性基因VHL。然后从mRNA和蛋白水平证明了HBV-DNAP对VHL的影响,最后证明了其能够下调VHL的表达,而过表达VHL后能够抑制肝癌细胞的恶性行为,相反敲降VHL后能得到相反的结果,因此猜测HBV-DNAP可能是通过VHL来促进对肝癌细胞生长、转移及侵袭等恶性行为的影响,因此,最后通过挽救实验证明了HBV-DNAP能够通过靶向VHL来实现对肝癌细胞活性增殖、迁移以及侵袭能力的促进作用。【结论】本文发现在肝癌细胞系Huh7,HepG2中,过表达HBV-DNAP能够促进肝癌细胞的生长、迁移、侵袭能力以及EMT的发生,并且HBV-DNAP能够下调VHL的表达。而VHL能够抑制肝癌细胞的生长、迁移、侵袭能力以及EMT进程,进一步通过对其机制的研究,发现HBV-DNAP通过促进VHL mRNA的降解从而实现对肝癌细胞恶性行为的促进作用。为进一步揭示肝癌发生发展中的分子机制提供了新的探究基础。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7;R512.62
【图文】：

肝癌细胞,表达质粒,质粒,细胞活性

图 1-1：表达质粒 HBV-DNAP 的有效性在 Huh7（A）和 HepG2（B）肝癌细胞中转染质粒 pCD3/Flag 和 pCD3/Flag-HBV-D转染后 36h，裂蛋白进行 Western blotting 实验，检测其在 Huh7 和 HepG2 细胞中的表1.2.2 HBV-DNAP 促进肝癌细胞的活性为了进一步探究 HBV-DNAP 对肝癌细胞恶性行为的影响，首先通过 M验分析发现如图1-2所示，在不同时间点过表达HBV-DNAP都能使细胞活性图 1-2：MTT 检测 HBV-DNAP 对肝癌细胞 Huh7 和 HepG2 细胞活性的影响。A B

肝癌细胞,HepG2细胞,克隆形成,细胞活性

1.2.2 HBV-DNAP 促进肝癌细胞的活性为了进一步探究 HBV-DNAP 对肝癌细胞恶性行为的影响，首先通过 MTT 实验分析发现如图1-2所示，在不同时间点过表达HBV-DNAP都能使细胞活性升高。图 1-2：MTT 检测 HBV-DNAP 对肝癌细胞 Huh7 和 HepG2 细胞活性的影响。在 Huh7（A）和 HepG2（B）细胞中转染质粒 pCD3/Flag 和 pCD3/Flag-HBV-DNAP，并在转染后 48h、72h 和 96h 分别检测细胞在 A570 的吸光度值（*：p<0.05）1.2.3 HBV-DNAP 促进肝癌细胞的克隆形成能力为了进一步探究 HBV-DNAP 对肝癌细胞克隆形成能力的影响，进行了克隆形成能力实验。如图 1-3 所示：HBV-DNAP 明显促进肝癌细胞 Huh7 和 HepG2 的增殖能力。A BA B

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