乙肝病毒感染与复制对宿主磷脂代谢的影响研究

发布时间：2020-06-20 13:50

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)慢性感染具有发病率高、致病性强和发病机制不明确等特点。我们先前的研究提示磷脂代谢通路在HBV的复制中有重要作用。然而HBV复制与磷脂代谢物之间究竟有何关系还有待进一步研究。磷脂是组成生物膜的主要成分,还参与信号传导等过程,其生物功能越来越被大众所认知。磷脂结构具有高度复杂性和多样性,而且生物样品中某些重要的磷脂含量非常低。因此,很有必要开发一个具有高通量、高灵敏度且应用广泛的磷脂定量分析方法。本论文以感染HBV的患者血清和细胞模型为研究对象,旨在开发一种基于色谱质谱联用技术的磷脂定性与定量分析方法,并用此方法研究HBV感染后宿主磷脂代谢物水平的变化,再结合分子生物学研究技术综合研究HBV复制与宿主磷脂代谢之间的关系。本论文开发了一种基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(Ultrahigh-performance liquid chromatography system coupled to a triple-quadrupole mass spectrometer,UHPLC-MS)的磷脂分析方法,在10分钟内对生物样品中主要的10类磷脂进行定量分析。这10类磷脂包括磷脂酸(Phosphatidic acid,PA)、磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine,PE)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PI)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)、鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)、溶血磷脂酸(Lyso-phosphatidic acid,LPA)、溶血磷脂酰胆碱(Lyso-phosphatidylcholine,LPC)和溶血磷脂酰乙醇胺(Lyso-phosphatidylethanolamine,LPE)。我们开发的磷脂分析方法的检测限(Limit of detection,LOD)和定量限(Limit of quantitation,LOQ)分别为 0.04-33 pmol/mL 和 0.1-110 pmol/mL。而磷脂定性与定量分析通过三步实现,第一步和第二步分别在正离子模式和负离子模式下结合多反应监测模式、Product ion scan模式以及色谱峰的保留时间,尽可能在混合样品中鉴定更多的磷脂分子结构。从而为第三步生物样品定量分析提供有效的磷脂代谢物信息。我们还利用相对响应值对不同酰基链长度的MS响应差异进行定量校正,从而实现更准确的定量。将本研究方法应用于6类不同的生物样品(人血浆、大鼠血浆、A549细胞、16HBE细胞、脂肪细胞和大鼠肝脏)的磷脂分析进行适用性验证,最终在这6类生物样品中共鉴定10类磷脂308种磷脂分子结构,定量295种磷脂分子。因此,我们开发的UHPLC-MS磷脂分析方法具有高效率(尤其适用于大样本分析)、高灵敏度、高通量和广泛适用性。为了阐明HBV感染和复制与宿主磷脂代谢物之间的关系,我们分别分析了感染HBV的患者血清和细胞中的10类主要的磷脂代谢物水平。结果发现与HBsAg阴性(-)患者相比,HBsAg阳性(+)患者的PC、PE和LPA的含量升高,而PS、PG、PI和SM的含量降低。此外,我们在感染HBV并能稳定遗传HBV的细胞模型HepG2.2.15细胞中也证实了HBV感染和复制导致宿主的PC上调,PS、PG和PI下调。受试者特征工作曲线(Receiver operating characteristic,ROC)分析显示与其他磷脂相比,PC的水平变化能够更好的预测HBV感染,这提示PC可能是HBV感染潜在的生物标志物。然后我们进一步评估PC的合成与代谢通路中重要酶的表达水平,结果发现HBV感染后的细胞PC合成的关键酶PCYT1A和LPP1的mRNA和蛋白表达水平均上调。当我们通过转染小干扰 RNA(Small interference RNA,siRNA)进入 HepG2.2.15细胞中下调磷酸胆碱胞苷转移酶(Choline-phosphate cytidylyltransferase 1 A,PCYT1A)和磷脂酸磷脂酶(Lipid phosphate phosphatase 1,LPP1)的表达后,HBV的复制受到抑制。这些结果表明,HBV感染后细胞宿主的PC合成受到PCYT1A和LPP1活性的调控,提示PCYT1 A和LPP1可能成为HBV治疗的新的潜在的靶点。此研究为HBV感染和复制的发病机制提供了新的信息,为治疗HBV感染和复制提供潜在的新线索。综上所述,本文开发了一种基于UHPLC-MS的高效率、高灵敏度、高通量和广泛适用于大样本生物样本分析的磷脂定量分析方法。然后结合UHPLC-MS磷脂定量分析方法和分子生物技术研究HBV感染和复制与宿主磷脂代谢的关系,为研究HBV感染的致病机制和治疗提供了新的线索。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R512.62;O657.63
【图文】：

基因组序列,基因组结构,蛋白,长链

含ＨＢｓＡｇ），因其不含病毒ＤＮＡ而不具感染性。管形颗粒由ＨＢｓＡｇ组成，无逡逑感染性。ＨＢＶ的基因组为单拷贝的不完整双链ＤＮＡ，由长度不等的正负两条链逡逑构成（图１．１）。长链为负链，长度恒定，由约３２００个核苷酸构成，拥有完整的、逡逑贯穿整个基因组序列的结构。短链为正链，长度可变化，约为长链的５０％？８０％，逡逑其延伸只覆盖了大约三分之二的病毒基因组长度。ＨＢＶＤＮＡ的长链含有四个开逡逑放阅读框，分别是Ｓ区、Ｃ区、Ｐ区和Ｘ区，编码ＨＢＶ的全部己知蛋白。逡逑Ｓ区又分为前Ｓ１、前Ｓ２及Ｓ三个编码区，分别编码ＰｒｅＳｌ、ＰｒｅＳ２及ＨＢｓＡｇ逡逑蛋白，三者共同构成ＨＢＶ的包膜蛋白。Ｃ区由前Ｃ基因和Ｃ基因组成，分别逡逑编码（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｅａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｅＡｇ）和（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｃｏｒｅａｎｔｉｇｅｎ，ＨＢｃＡｇ）蛋白，逡逑其中ＨＢｃＡｇ是ＨＢＶ核衣壳的重要组成部分，而ＨＢｅＡｇ既不是病毒的结构逡逑蛋白，也不是病毒复制所必需，主要分泌到宿主细胞外。Ｐ区编码多种功能蛋白，逡逑包括具有反转录酶活性的ＤＮＡ聚合酶、ＲＮＡ酶等

甘油磷脂,溶血磷脂,鞘磷脂

／逦＼逦０．７邋ｋｂ邋Ｘ邋ｍＲＮＡ逡逑ＢＣＰ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋Ｅｎｈａｎｃｅｒ邋ＩＩ逡逑图１．１邋ＨＢＶ基因组结构及其编码蛋白［５］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｃｏｄｉｎｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋ＨＢＶ逡逑２０１５年，世界卫生组织（Ｗｏｒｌｄ邋ｈｅａｌｔｈ邋ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ）报道全球约有逡逑２．５７亿（相当于总人口的３．５％）慢性ＨＢＶ感染者［６］，且２０１５年的总死亡人逡逑数中约有８８．７万是死于ＨＢＶ感染Ａ邋ＨＢＶ感染的自然过程复杂、多变，临逡逑床上ＨＢＶ感染引起的疾病包括急性肝炎、慢性乙型肝炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ邋ｈｅｐａｔｉｔｉｓ邋Ｂ，逡逑ＣＨＢ）、肝硬化甚至肝细胞癌（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）等［５，８］。长期的逡逑ＨＢＶ感染可以引起脂肪肝、肝纤维化，严重的可发展为ＨＣＣ［５，８］。研究表明，逡逑ＨＣＣ与ＨＢＶ感染密切相关ｔ９＿１１］，全球有超过５０％的ＨＣＣ患者与ＨＢＶ感逡逑染密切相关

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