云南省怒江州独龙牛微孢子虫和环孢子虫分子流行病学调查研究

发布时间：2020-07-01 10:55

【摘要】：目的环孢子虫与微孢子虫作为人类肠道寄生虫常见种类,对人类生存环境造成污染,曾在世界多地爆发性流行,免疫力低下患者感染后可致脱水性腹泻直至死亡,严重威胁人类健康。独龙牛(Bos frontalis)在中国境内仅分布于云南怒江州独龙江和怒江流域,具有很高的经济利用价值与宝贵的遗传资源价值,环孢子虫与微孢子作为肠道寄生虫随粪便排出,可污染环境,由于其存在人兽共患感染型可造成人群感染。本研究利用巢式PCR特异性敏感性及准确性高的特点,选取云南省怒江州独龙牛为调查对象,对毕式微孢子虫和环孢子虫的感染情况进行调查;研究独龙牛的微孢子虫和环孢子虫基因型,为该地区人兽共患微孢子虫病和环孢子虫病的进一步研究提供理论依据。方法从2017年9月至2018年9月,在云南省怒江州福贡县、贡山县周边及村庄共五个地点分四个季节采集到1129份独龙牛粪便样本,用OMG试剂盒提取样本DNA。基于环孢子虫核糖体小亚基(18S rRNA)基因和微孢子虫内转录间隔区(ITS)基因中的多态区,利用巢式PCR扩增提取的样本DNA后凝胶电泳,将测到的阳性标本送测序,确定阳性率。测序结果利用NCBI进行序列检索,应用MEGA6、SPSS19.0、Cluster X 1.83等分子生物学软件进行序列比对分析和进化树绘制,确定虫种、基因型及流行规律。结果1.在怒江州采集到的1129份独龙牛粪便样本中,经巢式PCR扩增、凝胶电泳后测序,共检测到微孢子虫19份,感染率为1.68%(19/1129,95%CI0.93%~2.43%),五个地点总感染率其中福贡县的鸠门当感染率为0(0/218),古泉村感染率为2.73%(6/220,95%CI 0.58%~4.88%),亚左洛村感染率为0.87%(2/231,95%CI 0~2.07%),贡山县茨开镇感染率1.28%(3/234,95%CI0~2.72%),独龙江乡感染率3.54%(8/226,95%CI 1.13%~5.95%),五个地点感染率(P=0.026,差异有统计学意义)。四个季度总感染率其中春季感染率为1.10%(3/272,95%CI 0~2.34%),夏季感染率为3.26%(9/276,95%CI1.17%~5.36%),秋季感染率为1.28%(4/312,95%CI 0.03%~2.53%),冬季感染率为1.12%(3/269,95%CI 0~2.38%),四个季度感染率(P=0.137,差异无统计学意义)。19份阳性样本中鉴定出4种已知基因:EbpC(n=6)、CHN3(n=3)、CHN4(n=4)、BEB4(n=4);两种新基因型分别命名为YNNJ1,YNNJ2。2.采集到的1129份独龙牛粪便样本中,共检测到环孢子虫17份,感染率为1.51%(17/1129,95%CI 0.80%~2.22%),五个地点总感染率其中鸠门当感染率为0(0/218),古泉村感染率为0.91%(2/220,95%CI 0~2.16%),亚左洛村感染率为1.29%(3/232,95%CI 0~2.74%),贡山县茨开镇感染率1.71%(4/234,95%CI 0.05%~3.37%),独龙江乡感染率3.54%(8/226,95%CI1.13%~5.95%),五个地点感染率(P=0.036,差异有统计学意义)。四个季度总感染率其中春季感染率为0.74%(2/272,95%CI 0~1.76%),夏季感染率为2.90%(8/276,95%CI 0.92%~4.88%),秋季感染率为0.64%(2/312,95%CI0~1.55%),冬季感染率为1.86%(5/269,95%CI 0.25%~3.47%),四个季度感染率(P=0.090,差异无统计学意义)。结论本研究首次分析了云南省怒江地区独龙牛微孢子虫的人兽共患基因型种类和环孢子虫种类。独龙牛微孢子虫春夏秋冬感染率分别为1.10%(3/272)、3.26%(9/276)、1.28%(4/312)、1.12%(3/269);独龙牛环孢子虫春夏秋冬感染率分别为0.74%(2/272)、2.90%(8/276)、0.64%(2/312)、1.86%(5/269)。成功鉴定出毕氏微孢子虫基因型:EbpC、CHN3、CHN4、BEB4、YNNJ1、YNNJ2,全部为人兽共患基因型,其中YNNJ1、YNNJ2是本次研究鉴定出的新型微孢子虫,丰富了该虫种的基因型。分析发现微孢子虫不同地点感染率差异有统计学意义,地点是微孢子虫感染的风险因素,以独龙江乡感染率最高;不同季度感染率差异无统计学意义,微孢子虫感染不受季节影响。本实验鉴定出环孢子虫都为牛环孢子虫,分析发现环孢子虫不同地点感染率差异有统计学意义,地点是环孢子虫感染的风险因素,以独龙江乡感染率最高;不同季度感染率差异无统计学意义,环孢子虫感染不受季节影响。
【学位授予单位】：大理大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R531.5;R181.3
【图文】：

微孢子虫,生活史

微孢子虫及环孢子虫研究进展3图1.1 毕氏肠微孢子虫生活史Fig. 1.1 Life cycle of Enterocytozoon bieneusi1.1.2 形态结构微孢子虫孢子阶段具有感染力，成熟的孢子呈椭圆形，大小约1-3μm×1.5-4μm[11]，其中毕式微孢子虫体积最小为1μm×1.5μm孢子由内生孢子层和糖蛋白层两部分构成，糖蛋白层包括糖蛋白外壳和角质内层对外界抵抗性强，保护内生孢子层的孢子质及遗传物质[12]。孢子质位于内部被几丁质组成的孢子内壁环绕，主要包括：一个根据种类不同呈单核或双核含遗传物质的孢子核、一个顶端锚定盘、一个盘绕状的极丝（可形成极管）、一个具有感染性的板层状可能包含非典型高尔基体的膜质的极胞体、核糖体、内质网等[13-15]。极管是微孢子虫感染宿主细胞时由极丝形成输送孢子内容物进入细胞质的中空管状结构，在感染中起决定作用，也是微孢子虫最显著的结构[16]。孢子结构如图1.2所示[16]。

结构图,微孢子虫孢子,结构图,微孢子虫

微孢子虫及环孢子虫研究进展4图1.2 微孢子虫孢子结构图Fig1.2 Diagram of a Microsporidian spore1.1.3 分类学与系统发育微孢子虫现已被归类为真菌，属于真核生物[15, 16]；但也有报道微孢子虫在电子显微镜下缺乏某些典型真核生物结构（线粒体、高尔基体等），反而具有原核生物才具备的小核糖体；结合核结构、分子细胞特征、核糖体沉降系数等指标将其划分为源真核生物[11, 17]。1857年首次发现微孢子虫后，1882年创立微孢子目，1976年创立微孢子门，两者于1980年划分入原生动物亚届[3, 11, 18]；160多年人们对微孢子虫的分类一直存在不同意见，曾被归类为：原生动物[11]、真菌[19]、藻类和酵母孢子[4]等。美国国立生物技术信息中心（NCBI）将微孢子虫划分为真菌界，孢子门

【参考文献】