USP18对不同干扰素抗HBV的影响及可能机制

发布时间：2020-07-01 10:08

【摘要】：目的:慢性乙型肝炎是全球关注的健康问题,泛素特异性蛋白酶18属于干扰素刺激基因,本研究旨在探讨USP18对Ⅰ型干扰素(IFNα)及Ⅲ型干扰素(IFNλ)抗HBV的影响及其相关机制。方法:将HepG2.2.15细胞随机分为空白对照组、USP18过表达+IFNα组、空载+IFNα组、USP18过表达+IFNλ组、空载+IFNλ组。空白对照组未经任何处理,其余几组采用脂质体转染法分别转染pEGFP-USP18,PEGFP-N1 质粒 DNA 48 小时后,采用 Western blot 检测USP18的相对表达量。其次,分别用IFNα及IFNλ对转染48小时后的细胞进行24小时的药物干预,采用Western blot,RT-qPCR检测JAK/STAT信号通路和ISG15,MXA,IFIT1及HBcAg的表达情况;化学发光法检测细胞上清中的HBeAg及HBsAg;PCR荧光探针法检测细胞上清中的HBV-DNA表达情况。结果:首先,USP18蛋白相对表达量在USP18过表达组中最高,USP18成功过表达,差异有统计学意义(P0.05);其次,在IFNα处理组中,空载组中HBsAg,HBeAg及HBV-DNA的表达均低于USP18过表达组,差异有统计学意义(P0.05),而IFNλ处理组中,三者差异不大;并且,在IFNα干预组中,阳性对照组的抗病毒蛋白ISG15,MxA,IFIT1表达均高于USP18过表达组,差异有统计学意义(P0.05),而在IFNλ干预组中仍无太大差别;最后,JAK/STAT信号通路上的pSTAT1在IFNα干预组中,USP18过表达组明显低于空载组,差异有统计学意义(P0.05),反之,在IFNλ干预组中,试验组与对照组仍无明显差别。结论:USP18通过抑制JAK/STAT信号通路的激活,从而减少抗病毒蛋白的表达,最终降低了 IFNα抗HBV的活性及复制能力。相比之下,USP18对IFNλ通过JAK/STAT通路抗HBV无明显抑制作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R512.62
【图文】：

逑置荧光显微镜下，随机取１０个高倍镜视野观察绿色荧光蛋白的表达，分别计算带逡逑绿色荧光蛋白细胞数及细胞总数，两者百分比计为转染效率（图１）。逡逑ｍｍ逡逑ｍｕ逡逑ｌｉｇｈｔ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（邋ｘ邋１邋Ｏ）逦ｆｌｕｏｒｏｓｃｏｐｅ邋（ｘ邋１０）逡逑图１．空载和ＵＳＰ１８过表达质粒载体转染ＨｅｐＧ２．２．１５细胞４８小时后光镜（ｘｌ0）和荧光镜逡逑（ｘｌ0）下观察细胞及荧光细胞，大概估算转染效率。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ＨｅｐＧ２．２．１５邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｆｏｒ邋４８邋ｈ邋ｉｎ邋ｓｉｘ－ｗｅｌｌ邋ｐｌａｔｅｓ邋ｗｉｔｈ逡逑ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ邋ａｎｄ邋ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８．ＧＦＰ．邋ＧＦＰ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｏｂｓｅｒｖｅｄ邋ｕｎｄｅｒ邋ｌｉｇｈｔ邋ａｎｄ逡逑ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋（ｘｌ0）＃逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ测量各组ＵＳＰ１８蛋白相对表达量。结果显示转染ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８逡逑组的ＵＳＰ１８蛋白表达量明显高于ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ转染组和空白对照组，ＵＳＰ１８成功过逡逑表达（图２Ａ）。进一步通过ＲＴ－ｑＰＣＲ检测质粒转染细胞４８小时后，再分别经ＩＦＮａ逡逑（１００ＩＵ／ｍｌ）和邋ＩＦＮＸ邋（５０ｎｇ／ｍｌ）处理邋２４邋小时的细胞邋ＲＮＡ，ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８邋组明显逡逑高于ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ组和阴性对照组（ｐ＜０．０５，图２Ｂ）。ＵＳＰ１８过表达细胞模型成功构逡逑建，可继续用于后续实验。逡逑２０逡逑

Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ测量各组ＵＳＰ１８蛋白相对表达量。结果显示转染ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８逡逑组的ＵＳＰ１８蛋白表达量明显高于ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ转染组和空白对照组，ＵＳＰ１８成功过逡逑表达（图２Ａ）。进一步通过ＲＴ－ｑＰＣＲ检测质粒转染细胞４８小时后，再分别经ＩＦＮａ逡逑（１００ＩＵ／ｍｌ）和邋ＩＦＮＸ邋（５０ｎｇ／ｍｌ）处理邋２４邋小时的细胞邋ＲＮＡ，ｐＥＧＦＰ－ＵＳＰ１８邋组明显逡逑高于ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ组和阴性对照组（ｐ＜０．０５，图２Ｂ）。ＵＳＰ１８过表达细胞模型成功构逡逑建，可继续用于后续实验。逡逑２０逡逑

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本文编号：2736619