通过化学分析方法研究转录因子Flo8在调节白色念珠菌菌丝形成中的作用

发布时间：2020-07-10 13:39

【摘要】：随着科技进步、医学发展及现代生活方式的改变,临床上由条件致病真菌引起的感染愈发严重,其中,白色念珠菌(Candida albicans)最为常见。临床抗真菌药物的缺乏以及耐药菌株的迅速出现和传播,增加了真菌感染治疗的难度。因此深入开展白色念珠菌致病机制的研究对临床上白色念珠菌感染的预防、诊断、治疗及预后意义重大。白色念珠菌引起感染的主要原因是其毒力因子的存在。与传统药物相比,靶向毒力不会威胁白色念珠菌的生存,大大降低了其耐药的发生机率,因此近年来在寻找新的抗真菌策略过程中科学家们着眼于将真菌毒力作为药物作用的新靶点。酵母态向菌丝态的形态转化是白色念珠菌重要的毒力因子。在白色念珠菌侵入组织的过程中,酵母态有利于繁殖和传播,菌丝态有利于黏附和侵袭,二者频繁转化,促进白色念珠菌的定植和感染。因此抑制白色念珠菌形态转化可以阻止其向致病形态转变,进而降低其感染能力,可作为一种有效的抗真菌策略。据文献报道,在体外实验中,白色念珠菌转录因子Flo8的缺失阻断了菌丝的形成和菌丝特异性基因的表达,并且FLO8基因缺失菌株在小鼠系统性念珠菌感染模型中是无毒性的。因此,为了寻找与形态转化有关的潜在的药物靶点,本课题选取Flo8作为研究对象,采用化学分析的方法对比Flo8敲除菌株与其回补株在多种重要合成通路上化学成分含量差异,来研究转录因子Flo8是如何调节白色念珠菌菌丝形成的。利用高效液相色谱法(HPLC)分析菌株胞内及胞外(培养基)提取物化学成分的差异,我们发现flo8△/△菌株菌体粗提物中甲硫腺苷(MTA)含量明显升高。气相色谱质谱联用(GC-MS)分析结果显示,flo8△/△菌株法尼醇含量均是野生株SC5314的2倍左右,flo8△/△菌株法尼醇胞外分泌增多。98%以上的甲硫腺苷(MTA)是通过多胺合成途径产生的,MTA可通过蛋氨酸补救途径转换为S-腺苷甲硫氨酸(SAM),参与多胺的生物合成。在白色念珠菌中,多胺合成途径与菌丝的生长、毒力及耐药性密切相关。在白色念珠菌中,多胺能够诱导其向菌丝态转化,抑制多胺的合成则会抑制菌丝的形成。因此,本课题采用外标法分析了多胺合成通路上相关成分的含量。在探索了不同提取和检测方法后,最终采用高氯酸超声萃取法提取白色念珠菌中的甲硫腺苷(MTA)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM),并采用HPLC-DAD方法检测其含量;采用芴甲氧羰酰氯(FMOC-C1)柱前衍生化结合HPLC-FLD的方法检测,腐胺(PUT)、亚精胺(SPD)、精胺(SPM)的含量。结果发现,在FLO8敲除菌株中,MTA及PUT含量升高,SPD、SPM含量下降,多胺水平下降,表明基因敲除菌株中多胺合成通路被抑制。甾醇作为细胞膜脂质的重要组成成分,也与白色念珠菌的形态转化密切相关,抑制甾醇合成通路,能够抑制白色念珠菌菌丝形成能力。文献报道,抑制白色念珠菌ERG11表达,会导致菌丝形成能力缺陷。本课题采用内标法分析了FLO8敲除菌株及其回补菌株在甾醇合成通路上相关成分的含量差异。采用GC-MS联用的方法分析了酵母甾醇(Zymosterol)、粪甾醇(Fecosterol)、麦角甾醇(Ergosterol)、羊毛甾醇(Lanosterol)、4,4-二甲基酵母甾醇(4,4-dimethylzymosterol)。结果发现在甾醇合成通路中,敲除菌株中甾醇中间体Zymosterol、Fecosterol、Lanosterol、4,4-dimethylsterol含量升高,Ergosterol含量几乎没有变化,甾醇中间体的大量累积使Ergosterol在细胞膜中比例下降,菌丝形成受到抑制。另外,敲除株麦角甾醇合成通路中法尼醇含量增加,抑制了Cdc35的活性,从而使cAMP合成受阻,表明Flo8可通过调控甾醇合成通路影响cAMP-PKA通路,影响菌丝形成能力。另外,有趣的是,在甾醇合成通路中,由Zymosterol向Fecosterol转化需要SAM参与,因此多胺合成通路与甾醇合成通路能够通过共同的底物SAM联系在一起,共同调控菌丝的形成。由于多胺合成通路和甾醇合成通路各成分含量发生了变化,本课题进一步采用实时荧光定量PCR(qPCR)的方法检测了 FLO8基因敲除菌株与回补菌株在多胺合成通路和甾醇合成通路上相关基因的表达量,从基因水平上验证这些化学成分的变化。结果发现在多胺合成通路中,催化鸟氨酸脱羧形成PUT的鸟氨酸脱羧酶编码基因SPE1、SAM脱羧酶编码基因SPE2、催化SPM氧化成SPD的多胺氧化酶编码基因FMS1表达量上调,MTA磷酸化酶MEU1表达量下调,而SPD合成酶编码基因SPE3和SPM合成酶编码基因SPE4受负反馈调节表达上调,与含量检测结果是一致的。甾醇合成通路中编码甾醇C-24甲基转移酶的基因ERG6表达量上调。此外,编码法尼醇合成酶的基因DPP3表达量上调。以上结果表明,FLO8基因敲除菌株菌丝形成能力的降低与多胺合成通路被抑制,甾甾醇合成通路中间体积累、麦角甾醇相对含量下降有关。综上所述,FLO8基因敲除的白色念珠菌表现为酵母态,主要是通过以下三个方面来降低毒力的:(1)FLO8基因敲除,使得多胺合成通路受阻,多胺整体水平下降,抑制了酵母态向菌丝态转化,毒力降低;(2)FLO8基因敲除,甾醇中间体累积,麦角甾醇比例下降,菌丝形成能力减弱,毒力下降;(3)FLO8基因敲除,DPP3表达量增加,法尼醇合成增加,通过抑制Ras1-cAMP-Efg1信号通路,抑制菌丝形成,使毒力下降。多胺合成通路、甾醇合成通路以及cAMP-PKA信号通路,这三种通路构成了一个调控网络,转录因子Flo8正是通过这个复杂的、彼此联系又相互制约的网络来调控白色念珠菌菌丝形成。本论文着眼于靶向毒力的抗真菌新策略,采用化学分析方法分析了相关通路上的化学成分变化,研究了转录因子Flo8缺失使白色念珠菌毒力下降的原因。该研究提供了一个抗真菌毒力的新思路,即通过干预化学成分的合成来抑制菌丝形成能力,降低毒力,为研究靶向毒力提供了理论基础。由化学成分变化结合调控它们的基因变化共同研究菌丝调控机制,提供了一个通过化学分析方法来研究并解决生物学相关问题的新方法。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R519.3

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