HBV慢性感染患者血小板动力异常及其血小板减少的免疫机制

发布时间：2020-07-11 12:14

【摘要】：第一部分乙肝病毒慢性感染血小板动力异常研究背景及目的：血小板减少是乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)慢性感染常见的并发症,在HBV感染疾病早期出现血小板减少提示疾病进展,预后不良。血小板减少与失代偿期肝硬化,肝移植及死亡相关。目前关于HBV慢性感染患者的血小板减少的机制并不完善,许多因素参与了HBV慢性感染的血小板减少,而且在疾病进展不同阶段,影响血小板减少的主要因素可能不同。本研究在HBV感染发展的各阶段,分析血小板动力指标包括网织血小板(Reticulated platelet, RP),糖盏蛋白(glycocalicin, GC)及血小板生成素(thrombopoietin, TPO)的变化其表面膜蛋白CD41a及CD42a的表达情况。材料和方法：肝硬化患者肝功能按照Child-Turcotte-Pugh (CTP)评分进行分级。本研究共纳入114名研究对象,其中包括：30名慢乙肝(chronic hepatitis B, CHB)患者；39名代偿期肝硬化患者(Child A)其中包括20名Child A无小板减少的患者和19名Child A伴血小板减少的患者；以及45名失代偿期肝硬化患者(Child B/C)均伴血小板减少。GC及TPO的分析采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测。RP及CD41a及CD42a分析采用流式细胞仪检测。结果：TPO水平在无血小板明显减少的ChildA组开始出现降低,在失代偿期肝硬化患者(Child B/C)组出现明显降低。Child B/C组血浆TPO水平和血浆白蛋白水平明显相关(r=0.65,p0.01)。RP及GCI在HBV慢性感染各组均明显升高,包括慢乙肝组及Child A无血小板减少组。表达CD41a及CD42a的绝对血小板计数各组均明显低于正常。同时表达CD41a及CD42a血小板占血小板总数的百分比(CD41a+CD42a+%)在Child B/C组明显升高。在CHB组与Child A无血小板减少组,CD41a+CD42a+%与HBVDNA拷贝数负相关(CHB, r=-0.72, p0.01; ChildA无血小板减少组,r=-0.50,p0.05)。结论：HBV慢性感染患者在血小板数目发生减少之前,血小板的动力指标已经发生异常。HBV慢性感染血小板减少的机制是涉及多个方面的,在慢乙肝阶段可能是以破坏增多为主,在失代偿期肝硬化阶段,既有破坏增多也有生成的不足。第二部分Breg细胞在HBV慢性感染中的作用研究背景及目的：HBV慢性持续性感染是病毒、机体免疫等多种因素复杂作用的结果。对于HBV病毒清除最重要的是HBV特异性细胞毒性T细胞(HBV specific cytotoxic T lymphocytes, HBV-specific-CTL)的强度和效能。HBV的慢性持续性感染涉及机体固有免疫及适应性免疫,细胞免疫在病毒的清除中是十分重要的。近来研究显示调节性B细胞(Regulatory B cell, Breg)发挥重要的免疫调节或抑制功能。有研究表明人体内分泌白介素10 (Interleukin-10, IL-10)的CD5+B细胞是一群具有免疫调节功能的细胞,关于这群细胞在病毒感染性疾病中的作用目前尚不清楚,本研究进一步明确分泌IL-10的CD5+B细胞是否参与HBV慢性感染的机制。材料和方法：本研究纳入68名研究对象,其中20名健康对照,48名HBV慢性感染患者(25名慢乙肝患者(Chronic hepatitis B, CHB)及23名肝硬化(Liver cirrhosis, LC)患者),采用ELISA方法检测血浆IL-10及丫干扰素(Interferon-γ, IFN-γ)水平,流式细胞计数检测外周血CD5+CD19+及人类白细胞抗原A2阳性(human leucocyte antigen A2, HLA-A2)细胞表达。IL-10+CD5+CD19+细胞采用非特异性刺激细胞后细胞培养胞内染色的方法检测。采用HLA—-肽五聚体法(Pentamers)结合流式细胞技术直接检测慢性乙肝患者外周血中的HBV-specific-CTL细胞特异性 CD8+T细胞(Pro5(?)MHC Pentamer (A*02:01/FLPSDFFPSV Pro5(?)MHC Pentamer staining of HBV core 18-27-specific T cells)。用磁珠分选出CD8+细胞和Breg细胞,体外培养研究两者之间的相互作用。结果：CHB组及LC组CD5+CD19+细胞占外周单个核细胞的比例明显高于健康对照组,分泌IFN-7的CD8+细胞比例在CHB组明显升高,表达CD107a的CD8+细胞比例在CHB及LC组均升高。CHB组血浆IFN-y, IL-10水平升高。在48位HBV慢性感染患者中有13位HLA-A2+的患者,其中有7位患者外周血检测到HBV-specific-CTL细胞。将这7名患者单个核细胞分选后体外培养有5位患者CD5+CD19细胞抑制HBV-specific-CTL细胞及非特异性CD8+细胞的功能。结论：HBV慢性感染患者CD5+CD19+细胞可能会影响特异性及非特异性CD8细胞的功能。第三部分慢乙肝不同疾病进程中血小板减少的免疫机制研究背景及目的：血小板减少是慢乙肝肝硬化患者常见的并发症,但是在慢乙肝无肝硬化阶段也有部分患者发生血小板减少。在第一部分研究表明即使血小板数目未发生明显减少的患者,血小板动力指标已经出现异常,这用传统的观点无法解释的。研究表明,慢乙肝及肝硬化患者未发生血小板减少时已有血小板动力的异常,伴或不伴血小板减少的慢乙肝患者均有免疫的异常,基于第二部分研究,本部分进一步明确细胞免疫及CD5+CD19+细胞是否参与HBV慢性感染患者血小板减少的机制。材料和方法：本研究共纳入88名研究对象：包括25名慢乙肝患者,25名代偿期肝硬化患者(其中12名Child A无小板减少的患者,13名Child A伴血小板减少的患者),及18名Child B/C患者,以及20名健康对照者。采用ELISA方法检测血浆IL-10及IFN-γ水平,采用流式细胞计数检测CD5+CD19+细胞表达。采用非特异性刺激后细胞培养胞内染色的方法检测IL-10+CD5+CD19+细胞表达。HBV-specific-CTL细胞的检测采用Pro5(?)MHC Pentamer (A*02:01/FLPSDFFPSV Pro5(?)MHC Pentamer staining of HBV core 18-27-specific T cells)方法。结果：血小板数量与IFN-γ+CD8+细胞比例在慢乙肝组呈现负相关(r=-0.51,p=0.01)。慢乙肝组和肝硬化各组血小板数量均与CD107a+CD8+细胞比例呈负相关(CHB r=-0.57, p = 0.03; LC r=-0.50,p= 0.03)。CHB组及肝硬化组的CD5+CD19+细胞百分比均高于健康对照组。肝硬化组CD5+CD19+细胞百分比与血小板数目呈负性相关。肝硬化组体外细胞培养上清液中IL-10水平较其余各组明显降低,但是其胞内IL-10平均荧光强度(Mean fluorescence intensity, MFI)最高。结论：HBV慢性感染患者血小板减少机制涉及多方面因素,HBV非特异性CTL细胞可能对血小板有直接的作用,并且可能参与早期血小板动力指标的变化。Breg细胞的功能在肝硬化失代偿期出现明显异常,并且可能会参与血小板减少机制。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62

【参考文献】