乙型肝炎病毒中国流行株C基因型稳定转染细胞模型的评价与应用

发布时间：2020-07-11 15:41

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染及其引起的一系列相关疾病是一种严重影响人类健康的全球性疾病,世界各国的科学家们从不同的方面对HBV感染的有效防治进行了大量的相关研究、探索和尝试。乙肝疫苗、干扰素(Interferon,INF)和核苷(酸)类似物(Nucleotide analogues,Nas)是现阶段防治慢性乙型肝炎病毒感染有效的主要手段,乙肝疫苗虽然可起到预防作用,但对已感染者、免疫耐受者和病毒逃逸株无效,而现阶段使用的抗病毒药物,存在副作用较大(干扰素)、易产生耐药(核苷类药物)、抗原血清转换率低等诸多缺点。建立细胞模型是研究病毒感染史、生物学特性、评价药物疗效、优化治疗方案、研究高效疫苗和开发新产品高效便捷的技术手段。现有的细胞模型包括病毒感染细胞模型、病毒瞬时转染细胞模型和病毒稳定转染细胞模型。对于病毒感染细胞模型,虽然近年发现了HBV的受体分子钠离子一牛磺胆酸共转运蛋白(Sodium taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP),但其感染效率仍然较低并且操作复杂,另外由于HBV严格的物种和组织特异性属性,限制了此种细胞模型的应用,病毒的瞬时转染系统在肝癌细胞中的病毒复制很难长期保持稳定,不适合实验的标准化的需要,如药物敏感试验。20余年来国内外已经建立了可以复制和分泌HBV病毒颗粒的稳定细胞系,如国际上公认的Hep G2.2.15细胞和Hep AD38细胞。其他实验室为了满足抗病毒耐药变异研究的需求,也相继建立起了耐药突变的HBV稳定复制细胞株,但仍然缺少我国流行的(B和C基因型)HBV毒株稳定复制细胞系和多重耐药细胞株;另外一些细胞株人为诱导的HBV突变细胞株,不能反映出病毒的自然遗传特征。因此,建立HBV中国流行株B和C基因型稳定复制细胞模型,符合我国临床实际,对于抗病毒药物的评价及乙肝防治方案的本土化具有积极作用。本实验室在前期的工作中通过联合应用PB转座子及其他技术构建了中国流行株C基因型野生株和耐药株的稳定转染细胞,本研究旨在对此稳转细胞的各项指标进行分析,并将其初步应用在体外抗HBV药效学评价上,期望该稳转细胞能够为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。目的:检测分析本实验室前期构建的HBV中国流行株C基因型稳转细胞:Hep G2.CW和Hep G2.LER细胞系的各项复制指标,评价该稳转细胞特性与经典HBV稳转细胞模型的差异;用临床常用核苷类药物来评价稳转细胞系用于药物评价的可靠性;设计用于表达新型小发卡rna(shorthairpinrna,shrna)的慢病毒载体,并考察其用于抗乙型肝炎病毒的可行性。方法:1、hbv稳定转染细胞特征分析:1)化学发光法定量检测hepg2.cw和hepg2.ler细胞上清hbv表面抗原(hepatitisbvirussurfaceantigen,hbsag)的表达和e抗原(hepatitisbviruseantigen,hbeag)的表达;2)荧光定量rcr法检测hepg2.cw和hepg2.ler细胞上清hbvdna的含量;3)酶联免疫吸附法定性检测胞内乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的表达;4)间接免疫荧光法检测胞内乙型肝炎病毒表面抗原的表达;5)间接免疫荧光法检测胞内乙型肝炎病毒核心抗原的表达;6)酶联免疫吸附法定性检测hepg2.cw和hepg2.ler细胞系细胞上清乙型肝炎病毒前s1抗原(hbvpres1)的表达。2、用临床常用核苷类药物来评价hepg2.cw和hepg2.ler细胞系用于药物评价的可靠性:选用我国三种临床常用核苷类药物:拉米夫定(lam)、恩替卡韦(etv)、阿德福韦酯(adv),稀释为0、0.001、0.01、0.1、1、10、100μm的一系列的浓度梯度,分别作用于hepad38(阳性对照)、hepg2.cw和hepg2.ler三种细胞系,连续正常培养九天后用荧光定量rcr法检测三种细胞上清乙型肝炎病毒dna的含量。3、新型小发卡rna慢病毒表达载体的构建及抗乙型肝炎病毒应用评价:对慢病毒载体骨架sapi位点进行突变,并将用于表达新型小发卡rna的结构亚克隆到改造后的慢病毒载体;设计靶向hbv保守序列的shrna并克隆到该慢病毒载体,包装含有shrna序列的重组慢病毒并进行定量,考察单个及多个shrna结构串联对慢病毒滴度的影响;将重组慢病毒感染hbv稳定转染肝细胞系hepg2.cw(moi=3),用l3稻霉素(blasticidin)筛选稳定克隆1周后,将其重新消化,并以1×105/孔接种于24孔板中,于铺板96h后取细胞上清检测hbsag、hbeag表达水平和hbvdna的含量。结果:1、稳定转染细胞特征分析结果:1)阳性对照hepg2.2.15细胞上清hbsag表达水平约为79ng/ml,hepg2.cw和hepg2.ler细胞上清hbsag表达水平约为85ng/ml和8ng/ml;2)阳性对照的hepg2.2.15细胞上清hbeag表达水平约为63ncu/ml,hepg2.cw和hepg2.ler细胞上清hbeag表达水平约为78ncu/ml和70ncu/ml;3)hepg2.cw和hepg2.ler细胞的hbvdna的含量均比阳性对照细胞hepg2.2.15高;4)hepg2.cw细胞胞内hbsag的表达水平比阳性对照hepad38细胞高,而hbeag的表达水平就比阳性对照hepad38细胞低;hepg2.ler细胞胞内hbsag和hbeag的表达水平均比阳性对照hepad38细胞低;5)hepg2.cw和hepg2.ler两种细胞系均有较好的表面抗原表达;6)hepg2.cw和hepg2.ler两种细胞系均有较好的核心抗原表达;7)阳性对照Hep AD38细胞上清HBV Pre S1表达水平OD值约为2.5,Hep G2.CW和Hep G2.LER细胞上清HBV Pre S1表达水平OD值约为3.5和0.8。2、用临床常用核苷类药物来评价Hep G2.CW和Hep G2.LER细胞系用于药物评价的可靠性,发现随着药物浓度的增加,阳性对照细胞Hep AD38和待评价细胞Hep G2.CW细胞上清HBV DNA的量均出现均匀的下降趋势;而Hep G2.LER细胞上清HBV DNA对LAM和ETV敏感度下降,ETV的作用也仅在药物浓度1μM之后对HBV DNA的量有一定抑制趋势,ADV在药物浓度0.1μM时即对HBV DNA的量有明显的抑制。3、构建了一种用于表达新型小发卡RNA的慢病毒载体,通过设计靶向HBV保守序列的sh RNA实现了HBV复制的高效抑制,发现两个和三个sh RNA串联效果优于单个sh RNA。结论:1、两种稳转细胞系Hep G2.CW和Hep G2.LER细胞能够稳定支持HBV的复制和表达;2、Hep G2.CW对三种临床常用抗乙肝核苷类药物均敏,Hep G2.LER细胞株对LAM和ETV敏感度下降;3、本文构建的新型sh RNA慢病毒表达载体可作为防治慢性病毒感染如HBV感染的潜在有效手段之一。
【学位授予单位】：河南中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62

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本文编号：2750599