预防日本血吸虫感染长效药物的研究

发布时间：2020-07-14 14:12

【摘要】：血吸虫病是一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病。目前在世界范围内，约有74个国家和地区的6亿人受到血吸虫感染的威胁，有近2亿人感染血吸虫。寄生人体的血吸虫主要有6种，在中国流行的是日本血吸虫。血吸虫感染具有“伴随免疫”的特点，患者在其体内的血吸虫虫体被清除后不久即丧失对血吸虫感染的免疫力，当再次接触疫水可发生再次感染。日本血吸虫具有大量的保虫宿主，在自然界能形成血吸虫病流行的“自然疫源地”。疫区人群因生产与生活的需要，必须反复接触疫水，因而非常容易发生再感染。血吸虫虫卵沉积于肝组织，引起的持续性炎症反应导致虫卵肉芽肿、肝组织纤维化、肝功能障碍、劳动力丧失，甚至死亡是血吸虫感染对人体健康的主要危害。如果能采取预防性手段，使血吸虫幼虫在进入宿主体内后立即被杀灭或不能发育成熟为成虫并产卵，则可有效降低血吸虫感染对人体健康的损害。目前，由于血吸虫复杂的免疫逃避机制，使预防血吸虫感染疫苗的研宄存在严重障碍，现阶段控制血吸虫病流行仍主要依赖于化学药物治疗。最常用的血吸虫病治疗药物为吡喹酮，但因其对血吸虫童虫的杀灭效果不佳，不能用于预防血吸虫感染。上世纪八十年代早期，青蒿素及其衍生物的抗血吸虫活性被中国科学工作者发现。与吡喹酮不同的是，此类药物主要杀灭童虫期的血吸虫，因此这类药物主要用于预防血吸虫感染与早期治疗。有文献报道，在青蒿素衍生物中，若使用的剂量相同，青蒿琥酯（ArteSunate,AS)杀灭童虫的效果要明显优于蒿甲醚等其他衍生物。但青蒿琥酯亦存在半衰期较短，短时间内需反复用药，治疗成本高，病人的依从性低的缺点。若能延长青蒿琥酯在宿主体内的半衰期，则可以使其在宿主体内维持有效药物浓度的时间延长，不仅可以提高药物的治疗效果，亦可以更有效地预防血吸虫感染。在当前没有有效的预防血吸虫感染疫苗的情况下，给疫区人群及家畜使用长效的青蒿琥酯类药物，应该是达到预防血吸虫感染目标的理想策略之一。青蒿琥酯作为一种小分子化学药物，其本身及各种代谢产物极易在体内被肾小球滤过而被排出，从理论上讲，可以通过增加药物的流体动力学体积（比如将青蒿琥酯与某种大分子蛋白质偶联）来延长其半衰期，从而延长青蒿琥酯在体内维持有效药物浓度的时间，达到预防血吸虫感染的目的。本研宄采用化学偶联方法将青蒿琥酯与一种低免疫原性的人工蛋白一GST-XTEN'融合蛋白偶联，形成AS-GST-XTEN'偶联物，试图延长青蒿琥酯在宿主体内的半衰期，制备一种适合用于预防多种不同保虫宿主血吸虫感染的长效药物，以达到预防血吸虫感染、控制血吸虫病流行的目的。研宄内容主要包括以下几个方面：一、GST-XTEN'融合蛋白的表达与纯化根据Volker Schellenberger的设计策略，设计合成了全长为1368bp,分子量为41.858kDa的XTEN'蛋白基因，并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成了编码XTEN'蛋白的基因片段。将编码XTEN'蛋白的基因片段通过限制性内切}0}0m和/1位点亚克隆到表达载体pET41a中，构建成功重组表达质粒XTEN'-pET41a。将含重组表达质粒XTEN'-pET41a的转化子细菌接种到LB培养基中培养，用IPTG进行蛋白质诱导表达。通过对表达条件的优化，在细菌静止生长期用IPTG进行诱导，在37°C诱导4h，可表达出一分子量约120kDa的可溶性重组GST-XTEN'蛋白二聚体。采用Glutathione sepharose4B胶对重组蛋白进行亲和层析纯化，获得纯化的重组GST-XTEN'二聚体蛋白，纯度大于95%。二、GST-XTEN'蛋白与青蒿琥酯偶联物的制备及特性本研宄根据青蒿琥酯的化学结构特点，选择将青蒿琥酯长臂上的羧基与蛋白GST-XTEN'结构中的游离氨基用混合酸酐法进行偶联，制备了AS-GST-XTEN'偶联物。采用全波长分光光度计扫描法分别测定AS、GST-XTEN'和AS-GST-XTEN'偶联物的特征性吸收峰，结果发现AS-GST-XTEN'偶联物有自己特征性的紫外吸收峰，最大吸收波长为270nm，不同于AS (紫外最大吸收波长为260nm)和GST-XTEN'蛋白（最大吸收波长为280nm)，提示AS-GST-XTEN'偶联物制备成功。偶联率为1:506，平均每分子GST-XTEN'载体蛋白上结合了506个AS分子。将日本血吸虫童虫转移到预先加好培养液的24孔细胞培养板中，在含5%CO_2的37°C培养箱中培养。在实验孔中分别加入不同浓度的AS、AS-GST-XTEN'偶联物，分别于20min、4h、24h、48h后在倒置显微镜下观察虫体的死亡情况,同时设置RPMI1640对照组及5%NaHC03对照组。结果显示，AS杀虫用量小，速度快，而AS-GST-XTEN'同样具有杀虫效果，但是用药剂量大，杀虫速度慢。设置不同浓度梯度的AS、AS-GST-XTEN'，分别观察在各浓度下体外培养的日本血吸虫童虫死亡数量，计算两种药物对童虫致死作用的LD5。值。在同等作用时间内，若要达到相似的杀虫效果，AS-GST-XTEN'偶联物的剂量（此处指偶联物中所含AS的剂量）约是AS剂量的4倍。使用AS-GST-XTEN'偶联物经皮下注射直接免疫ICR小鼠（每只小鼠接种3|ug抗原，不添加任何免疫佐剂），每周一次，连续免疫六周。每只小鼠于免疫前、第4次免疫后1周（第29天）和第6次免疫后1周（第42天）经尾静脉采血，分离血清。分别以重组GST-XTEN'融合蛋白和AS-GST-XTEN'偶联物为抗原包被酶标板，采用间接酶联免疫吸附试验，检测免疫小鼠血清中抗重组GST-XTEN'蛋白及AS-GST-XTEN'偶联物的抗体IgG效价。实验结果显示：免疫后4周，小鼠血清抗体水平达到1:1600-1：3200之间，6周后抗体水平达到1:3200-1：6400之间。表明GST-XTEN'蛋白及AS-GST-XTEN'偶联物仍有一定的免疫原性，但免疫原性较弱。取66只小鼠，随机分为AS组及AS-GST-XTEN'组，两组小鼠分别经尾静脉注射AS(26.8mg/kg)或AS-GST-XTEN'偶联物(12.05mg/kg)，然后分别在给药后2min、15min、30min、1h、2h、5h、12h、24h、51h、72h、97h对小鼠进行尾静脉采血并分离血清，采用ELISA法（双抗体夹心法）分别测定给药后不同时间点AS组、AS-GST-XTEN'组小鼠体内AS含量的变化。检测结果显示单纯注射AS时，药物在小鼠血清中迅速达到峰值（2min)，但半衰期较短（约为30min)，与前人的研宄结果相吻合。而AS-GST-XTEN'偶联物给药组小鼠体内AS的浓度达到最高峰的时间明显向后推迟，为给药后的15min，半衰期为给药后2h，比单纯AS的半衰期明显延长。三、AS-GST-XTEN'偶联物治疗与预防血吸虫感染效果为观察AS-GST-XTEN'偶联物体内杀灭血吸虫童虫的效果，将30只ICR小鼠，随机分为三组，每只小鼠腹部感染日本血吸虫尾蚴35条，在血吸虫感染后第七天（肺期）分别经尾静脉注射AS或AS-GST-XTEN'治疗，并设立对照组。治疗剂量为AS注射组150mg/kg，AS-GST-XTEN'偶联物注射组600mg/kg (此处的剂量为偶联药物中所含AS的剂量）。对照组小鼠不给以任何药物治疗。感染后35天剖杀小鼠，收集成虫并计数，计算减虫率。结果显示，AS与AS-GST-XTEN'在体内对肺期日本血吸虫童虫的杀灭效果类似，均可获得约60%的减虫率，两者差异没有统计学意义（P0.05)。在预防血吸虫病的试验中，将70只小鼠随机分为七组（10只一组），对每只小鼠均采用尾静脉注射给药：组一、组二、组三为AS注射组，注射剂量为150mg/kg；组四、组五、组六为AS-GST-XTEN'偶联物注射组，注射剂量为600mg/kg(此处的剂量为偶联药物中所含AS的剂量）；组七不注射任何药物，作为空白对照组。组一、组四、组七在给药七天后模拟自然环境感染日本血吸虫尾蚴，组二、组五在给药十四天后模拟自然环境感染日本血吸虫尾蚴，组三、组六在给药二十一天后模拟自然环境感染日本血吸虫尾蚴，各组小鼠均在感染后35天剖杀，收集成虫并计数，计算减虫率。预防实验结果显示：对照组的平均虫荷为49.00±0.56条，单纯给以AS后7天感染组、14天感染组及21天后感染组小鼠体内的平均虫荷数分别为48.60±0.50条、48.30±0.73条、48.60±0.65条，与对照组相比差异均无统计学意义（P值均0.05); AS-GST-XTEN'偶联物给药后7天、14天和21天感染组，小鼠体内的平均虫荷分别为32.90±0.53条、48.80±0.66条和48.90±0.69条，AS-GST-XTEN'偶联物给药后7天感染组的减虫率达到32.86%，与对照组相比差异有统计学意义（P0.05)。但给药14天及21天后感染组小鼠体内的虫荷数与对照组相比差异无统计学意义（P值均0.05)。结论本研宄成功地构建表达GST-XTEN'融合蛋白的重组表达质粒XTEN'-pET41a，表达并制备了纯化的GST-XTEN'融合蛋白。制备了青蒿琥酯与GST-XTEN'蛋白的偶联物（AS-GST-XTEN')。AS-GST-XTEN'偶联物免疫原性低，在体内、外均具备杀灭血吸虫童虫的效果，在宿主体内的半衰期有显著的延长，初步具备了预防血吸虫感染的效果。
【学位授予单位】：江苏省血吸虫病防治研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R532.21
【图文】：

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【参考文献】