乙型肝炎病毒（HBV）相关性肝癌中ALDH1A3基因启动子区去甲基化及其表达的研究

发布时间：2020-07-18 06:40

【摘要】：目的:肝细胞肝癌是全球排名第五位的常见恶性肿瘤,其死亡率排在肿瘤死亡率的第三位。全球每年约有60万人死于肝癌。目前,已经确定的肝癌发病的危险因素中,乙型肝炎病(HBV)毒感染为最主要的危险因素。在世界各地,约有2.48亿人患有慢性乙型肝炎,在中国,有9500万人患有乙型病毒性肝炎,其中一些患者会缓慢发展成慢性乙型肝炎后肝硬化进而发展成肝细胞肝癌。目前,肝癌的诊治还存在早期诊断困难、缺乏有效治疗、复发转移率偏高、缺少创新药物等棘手问题,因此,对肝癌分子发病机制的研究和肝癌诊治新技术新药物的研发显得尤为重要。ALDH1A3是醛脱氢酶(ALDH)家族中的一员,主要负责将全反式视黄醛氧化成视黄酸而参与人体细胞的各种生理过程。越来越多的研究发现ALDH1A3表达受许多因素调节,并与肿瘤的发生、发展和预后相关。并且,ALDH1A3在多种肿瘤中表现出肿瘤干细胞(CSC)特征,与癌细胞的集落形成、球形成、肿瘤发生和血管生成活性密切相关。DNA甲基化作为表观遗传修饰的一种重要方式,在维持基因组DNA的基因印记、染色体的稳定、重复基因的转录沉默中起着重要作用。肝细胞肝癌表观遗传学上可发生广泛的DNA甲基化,且被证明与HBV感染相关,但HBV感染诱导DNA甲基化程度的改变在肝细胞肝癌发生发展中的作用尚未阐明。本研究利用肝癌组织临床标本及两种肝癌细胞系,采用甲基化芯片、甲基化PCR、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术,检测ALDH1A3基因在乙肝相关性肝细胞肝癌中甲基化程度及表达水平,初步探讨ALDH1A3基因与乙肝病毒感染性肝细胞肝癌的关系。方法:1.收集6例HBV高拷贝肝癌患者肝癌组织和6例无HBV感染肝癌患者肝癌组织标本均提取DNA,采用甲基化芯片技术对两组样本进行对比分析,筛选差异甲基化基因及差异甲基化位点,比较两组标本的整体甲基化状态及ALDH1A3基因甲基化程度的高低。2.收集并提取3例HBV高拷贝肝癌患者和3例无HBV感染肝癌患者的肝癌组织DNA,培养并提取表达HBV基因的HepG2.2.15肝癌细胞和HBV阴性的HepG2肝癌细胞的细胞DNA,根据芯片结果分析的差异甲基化位点设计ALDH1A3启动子区引物,采用甲基化特异性PCR(MSP)方法,在组织和细胞中进一步验证ALDH1A3基因启动子区甲基化差异。3.提取上一步骤中两组肝癌组织及两株肝癌细胞的总RNA和蛋白,采用Real-time PCR和Westernblot方法,分别对比组织及细胞中ALDH1A3基因在mRNA和蛋白水平的表达情况。所有数据均采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),进行正态及方差齐性检验,检验以P0.05为差异有统计学意义。结果:1.甲基化芯片分析结果显示:HBV高拷贝肝癌组织DNA整体呈现低甲基化状态,并且从存在甲基化差异的基因中筛选出ALDH1A3基因,呈现低甲基化状态。2.甲基化特异性PCR结果显示:HBV高拷贝肝癌组织ALDH1A3启动子区呈现低甲基化,而HBV阴性肝癌组织ALDH1A3启动子区呈现高甲基化,差异具有显著意义(P0.01);HepG2.2.15细胞ALDH1A3启动子区呈现低甲基化,而HepG2细胞ALDH1A3启动子区呈现高甲基化,差异具有显著意义(P0.01)。3.Real-time PCR和Western blot结果显示:HBV高拷贝肝癌组织较HBV阴性肝癌组织、HepG2.2.15肝癌细胞较HepG2肝癌细胞的ALDH1A3基因,在mRNA水平和蛋白水平的表达均升高,具有统计学意义(P0.05)。结论:乙型肝炎病毒相关性肝细胞肝癌全基因组呈现低甲基化且HBV介导了ALDH1A3基因启动子区的去甲基化及高表达。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.7;R512.62
【图文】：

例无 HBV 感染肝癌患者肝癌组织 DNA 样本，非监督聚类分析可见BV 感染状态不同，差异甲基化位点的热图聚类有显著差别（Fig.1） HBV 高拷贝组与 HBV 阴性组差异甲基化位点和基因数目进行统计存在差异位点 14,454 个，高甲基化位点 581 个，低甲基化位点 13,，共发现 3,436 个基因存在甲基化水平差异，甲基化程度升高基因 ，甲基化程度降低基因 3023 个（Fig.2），结果提示：HBV 高拷贝肝织 DNA 整体呈现低甲基化状态，并且从甲基化差异基因列表中筛选LDH1A3 基因，呈现低甲基化状态。

图 1 HBV 高拷贝组-HBV 阴性组差异甲基化位点热图聚类Fig.1 Cluster analysis of different gene methylation between High-copy HBVgroup and non-HBV group

Fig.2 Numbers of differentially methylated sites and DMR genes betweenhigh-copy HBV group and non-HBV group.(A)Numbers of differentiallymethylated sites.(B)Numbers of DMR genes2.甲基化特异性 PCR 验证 ALDH1A3 启动子区低甲基化取 3 对肝癌组织的 DNA，进行甲基化特异性 PCR（MSP）验证ALDH1A3 启动子区低甲基化。结果如图 3：3 例 HBV 高拷贝肝癌组织ALDH1A3 启动子区均呈现低甲基化状态，而 3 例 HBV 阴性肝癌组织的ALDH1A3 启动子区呈现高甲基化状态，两者差异具有显著意义（P<0.01）；在细胞水平应用 MSP 检测两株肝癌细胞 ALDH1A3 启动子区甲基化情况，结果如图 4：携带并稳定表达 HBV 基因的 HepG2.2.15 肝癌细胞 ALDH1A3 启动子区呈现低甲基化状态，而 HBV 阴性的 HepG2 肝癌细胞 ALDH1A3 启动子区呈现高甲基化状态，两者差异具有显著意义（P<0.01）。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 颜葱;涂晓璇;吴伟;童舟;张航瑜;刘璐璐;郑怡;赵鹏;蒋微琴;方维佳;;晚期肝癌综合治疗进展[J];中国肿瘤临床;2018年21期

2 代智;杨怡;;肝癌诊断标志物的新进展及应用[J];中国普外基础与临床杂志;2018年04期

3 吴洋洋;王爱平;董岚;孙亚臣;王瑶;王海莉;郝锐;;单独与联合介入治疗肝癌的临床对比分析[J];医学研究杂志;2017年09期

4 关文龙;;直接抗丙型肝炎病毒治疗可能恶化肝癌[J];抗癌之窗;2016年06期

5 王兴生;钱丽琼;;手术切除在肝癌多学科综合治疗中的地位[J];健康之路;2017年08期

6 李晓文;;卢国栋:“八桂大地”的肝癌科学工作者[J];科学中国人;2017年25期

7 薛开先;肝癌发生的分子遗传学和表遗传学研究[J];癌症;2005年06期

8 程黎明,王思元,林菊生;PTEN和p53蛋白在肝癌组织中的表达及意义[J];癌症;2003年01期

9 上田启次;凋亡抑制与肝癌发生[J];日本医学介绍;1997年07期

10 王富根;沈德美;刘亦法;朱伟萍;许良中;;肝癌高发家族中1例患者染色体的研究[J];中国肿瘤临床;1987年04期

相关会议论文 前10条

1 袁文丹;王东;;VEGF与细胞周期启动在肝癌发生发展过程中的作用[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年

2 曹骥;卢晓旭;胡艳玲;李瑗;朱伶群;杨春;唐艳萍;欧超;张春燕;;利用基因富集及元分析初步筛选影响肝癌发生发展的关键基因[A];全国肿瘤流行病学和肿瘤病因学学术会议论文集[C];2011年

3 刘耕陶;孙华北;方亚南;;肝癌发生的化学预防[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年

4 易宏淦;臧梦雅;吴志远;徐灵芝;曲春枫;;慢性肠道炎症状态可促进肝癌发生[A];第九届全国免疫学学术大会论文集[C];2014年

5 刘文斌;陈洪强;赵吉;舒为群;曹佳;刘晋yN;;微囊藻毒素诱导肝癌发生过程中的表观遗传调控和作用机制研究[A];中国毒理学会第九次全国毒理学大会论文集[C];2019年

6 谢静媛;戴炜;涂爱民;赵文高;符花;胡应龙;;深圳地区53例肝癌发生的相关因素探讨[A];全国第2届中西医结合传染病学术会议暨国家中医药管理局第1届传染病协作组会议论文汇编[C];2008年

7 何立雄;王灵巧;黄玉晶;谭瑶;王佳;舒为群;;Gankyrin:AFB1诱导肝癌发生的新靶点,基于AFB1暴露的致癌模型和肝癌患者的证据[A];2017环境与公共健康学术会议暨中国环境科学学会环境医学与健康分会、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会2017年年会论文集[C];2017年

8 韩志鹏;井莹莹;蔡雄;吴孟超;卫立辛;;干细胞与肝癌发生发展的研究与思考[A];发挥中西医优势治疗原发性肝癌——香山科学会议第461次学术讨论会画册[C];2013年

9 董志珍;姚登福;宗蕾;邱历伟;吴玮;吴信华;;肝癌发生早期胰岛素样生长因子-Ⅱ异常表达与改变特征[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年

10 舒宏;康晓楠;秦雪;刘银坤;;肝癌发生不同病理阶段血清蛋白筛选及结合珠蛋白的诊断价值[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 长沙市传染病医院感染科副主任医师 李金强;感染乙肝、丙肝 不可听之任之[N];大众卫生报;2017年

2 记者 佘峥 通讯员 薛志平 欧阳桂莲;为什么会得肝癌？原因搞清楚了[N];厦门日报;2017年

3 北京协和医院 王晶;肝癌疗效评价或有新标志物[N];健康报;2017年

4 记者 颜维琦 曹继军;我科学家揭示肝癌发生早期分子机制[N];光明日报;2012年

5 记者 胡德荣;肝癌发生早期阶段分子机制被揭示[N];健康报;2012年

6 通讯员 韦夏 本报记者 邓宏鹰 钟少鸿;不良饮食习惯易诱发肝癌[N];中国食品报;2009年

7 ;癌症早知道[N];人民政协报;2002年

8 张中桥;C2基因表达下调与肝癌相关[N];中国医药报;2003年

9 刘江峰 刘 涓;捕捉肝癌的“蛛丝马迹”[N];中国中医药报;2005年

10 指导专家 重庆医科大学附属第二医院感染病科教授 张大志 记者 苏云丽;AFP升高肝癌发生“第一信号”[N];医药导报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 杨云锋;KPNA2基因表达的分析检测及与肝癌的相关性研究[D];山西大学;2019年

2 郭俊;双氢青蒿素对肝癌肿瘤生物学行为的影响及机制研究[D];武汉大学;2016年

3 陈德凤;含D2剪接区Kinectin异构体在肝癌发生发展中的作用初步探讨[D];广西医科大学;2014年

4 程江红;Gab2介导肝癌发生的机制研究[D];厦门大学;2017年

5 蔡莹;HDAC3通过抑制POLQ介导的α-EJ修复通路阻碍HCC发生发展的机制研究[D];重庆医科大学;2019年

6 李传飞;TGFβ1-miR140-5p轴调控FEN1对肝癌上皮间质转化的作用及机制研究[D];重庆医科大学;2019年

7 林琳;miR-548b-3p通过其直接作用靶基因CIP2A抑制肝癌细胞的恶性生物学行为[D];中国医科大学;2019年

8 王帆;长链非编码RNA CADM1-AS1对肝细胞癌的作用及其机制研究[D];中国医科大学;2019年

9 张小东;低氧条件下YAP结合并稳定HIF-1α蛋白促进肝癌细胞糖酵解发生的机制研究[D];中国医科大学;2019年

10 丁凯;SOX9在肝癌发生中的作用及机制研究[D];中国人民解放军海军军医大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 包镇洁;隐匿性乙肝及相关肝癌的研究进展[D];重庆医科大学;2019年

2 何琳;鸟氨酸氨甲酰基转移酶在原发性肝癌中的表达分析及功能研究[D];重庆医科大学;2019年

3 高雪庆;乙型肝炎病毒（HBV）相关性肝癌中ALDH1A3基因启动子区去甲基化及其表达的研究[D];河北医科大学;2019年

4 杨士田;D~2AS模型预测早期肝癌价值验证并HBV相关性肝癌的早期诊断与预测模型[D];河北医科大学;2019年

5 杜瑞雪;黑参、黑蒜及其混合物对肝癌HepG-2细胞凋亡作用的影响[D];延边大学;2019年

6 刘殿星;HBV相关肝癌外泌体通过激活CMA途径诱导肝癌细胞化疗抵抗的机制研究[D];华北理工大学;2019年

7 陈e

本文编号：2760554