乙型肝炎病毒X蛋白调控cGAS信号通路的机制研究

发布时间：2020-07-18 09:31

【摘要】：目的:探讨乙型肝炎病毒X蛋白对cGAS信号通路的调控作用及其机制。方法:1.分别用pIFNβ-luc、pRL-PK质粒与pcGAS-Flag、pSTING-HA和pHBx质粒共转染HEK293细胞,转染24小时后收集细胞裂解液,运用多功能酶标分析仪检测荧光素酶活性,分析IFNβ的表达水平及HBX对IFNβ表达水平的影响。2.用pcGAS-Flag、pSTING-HA和pHBX质粒共转染HEK293细胞,分别检测各个时间点IFNβmRNA的表达水平及HBX对IFNβmRNA表达水平的影响。3.运用Western-blot及荧光定量PCR检测HepG2、HepG2.215、L02和SMMC-7721各个肝源细胞株中cGAS和STING的蛋白及mRNA表达水平。4.用pcGAS-Flag、pSTING-HA和pHBX质粒共转染HEK293细胞,提取蛋白并运用Western-blot分析磷酸化及二聚体形态的IRF3的表达水平的变化。5.用pHBX分别与pIRF3-Flag或pSTING-HA质粒共转染HEK293细胞,转染24小时后收集细胞裂解液,运用多功能酶标分析仪检测相对荧光素酶活性,分析pIRF3-Flag和pSTING-HA相应诱导的IFNβ表达水平及HBX对IFNβ表达水平的影响,探究HBX调控cGAS诱导的DNA信号通路的作用位点。6.以SMMC-7721细胞为模型,用pHBX质粒转染SMMC-7721细胞,提取蛋白并运用Western-blot分析HBX对cGAS蛋白表达量的影响;提取RNA并运用荧光定量PCR分析HBX对cGAS mRNA表达量的影响。7.用pHBX质粒转染SMMC-7721细胞,运用免疫共沉淀及荧光共定位分析HBX与cGAS的相互作用。8.利用3MA、Rapamycin处理SMMC-7721细胞或者用pHBX质粒转染SMMC-7721细胞,分别检测cGAS及LC3-II蛋白表达量的变化;在SMMC-7721细胞中共转染pGFP-LC3和pHBX或者用3MA、Rapamycin处理转染了pGFP-LC3质粒的细胞,在荧光显微镜下观察自噬颗粒,计数自噬细胞数,计算自噬发生率。结果:1.HBX负调控由cGAS介导的IFNβ的表达。2.在HepG2、HepG2.215、L02和SMMC-7721几个肝源细胞株中,均有STING的表达,但只有L02和SMMC-7721细胞表达cGAS。3.HBX的抑制作用是通过cGAS-STING-IRF3-IFNβ通路实现,且HBX主要通过作用于STING的上游环节进行调控。4.HBX对cGAS的蛋白表达量和功能均有抑制作用,但对cGAS的mRNA水平无影响。5.HBX与cGAS在细胞内共定位,且两者相互结合。6.HBX通过增强cGAS的自噬促进cGAS的降解,从而负调控cGAS信号通路。结论:HBX负调控cGAS信号通路可能因为两种因素:一方面HBX与cGAS相互结合,竞争抑制DNA与cGAS的结合;另一方面HBX增强cGAS的自噬性降解。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R512.62
【图文】：

光素酶活性为单位进行表示。我们发现，单独转染pcGAS-Flag或者小剂量的pSTING-HA未能激活IFNβ启动子活性，共转染pcGAS-Flag和pSTING-HA能够显著激活IFNβ启动子的活性（图1.1）。图1.1在HEK293细胞中转染相应表达质粒诱导IFNβ的表达，并运用双荧光素酶报告基因分析IFNβ的表达水平。Fig.1.1 HEK293 cells were transfected with the corresponding expression plasmid to induce theexpression of IFNβ, and the expression level of IFNβ was analyzed by the dual luciferase reportergene.2.1.2 HBX 负调控 cGAS 诱导产生的 IFNβ水平在此基础上，我们将pcDNA3.1-HBx或者空载体pcDNA3.1与诱导表达质粒共转染入HEK293细胞中，转染24小时后收集细胞裂解液检测相对荧光素酶活性，结果显示HBX能够显著抑制β干扰素启动子的活性，且抑制效率与HBX的浓度呈正相关（图1.2）。同时，将pcDNA3.1-HBx或者空载体pcDNA3.1与pcGAS-Flag、pSTING-HA共转染入HEK293细胞中，24小时后收集细胞提取RNA

染入HEK293细胞中，转染24小时后收集细胞裂解液检测相对荧光素酶活性，结果显示HBX能够显著抑制β干扰素启动子的活性，且抑制效率与HBX的浓度呈正相关（图1.2）。同时，将pcDNA3.1-HBx或者空载体pcDNA3.1与pcGAS-Flag、pSTING-HA共转染入HEK293细胞中，24小时后收集细胞提取RNA，利用实时荧光定量PCR检测IFNβmRNA，我们发现HBX对IFNβ的mRNA水平也有相同的影响（图1.3）。图1.2运用双荧光素酶报告基因分析转染pHBx后对cGAS诱导的IFNβ表达水平的影响。Fig.1.2 Effect of pHBx on cGAS-induced IFNβ expression by dual luciferase reporter gene assay.

重庆医科大学硕士研究生学位论文19图1.3 运用荧光定量PCR分析转染pHBx后对cGAS诱导的IFNβmRNA表达水平的影响。Fig.1.3 Effect of pHBx on cGAS-induced IFNβ mRNA expression by real-time PCR.先天性免疫应答诱导产生的I型干扰素发生于病毒感染的早期。为了验证IFNβ的达峰时间，我们在HEK293细胞中共转染pcGAS-Flag、pSTING-HA后分别在0h、6h、12h、18h、24h检测诱导产生的IFNβ的mRNA水平，并且在各个时间点转染pcDNA3.1-HBx观察抑制效果。我们发现IFNβmRNA在各个时间点均能被HBX抑制，且IFNβmRNA的表达水平在12小时至18小时之间达到高峰(图1.4）。这些结果证实，cGAS介导的信号通路能够诱导IFNβ的表达，该诱导作用于转染后12小时至18小时之间达到高峰。HBX能够显著抑制由cGAS信号通路诱导产生的IFNβ，且抑制效果与HBX呈浓度依耐性。图1.4 运用荧光定量PCR分析HBx在各个时间点对IFNβ表达水平的影响。Fig.1.4 Fluorescence quantitative PCR was used to analyze the effect of HBx on the expression ofIFNβ at various time points.2.1.3 各肝细胞株中 GAS、STING 的表达水平HBV为嗜肝的DNA病毒，为了更好的研究HBX的作用

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本文编号：2760711