免疫抑制性分子调节活动性结核的发病机制及其临床诊断应用

发布时间：2020-07-19 04:26

【摘要】：【目的】系统评估结核患者和健康人群的免疫功能。【方法】收集23例健康志愿者和38例结核患者的新鲜外周血,通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)。流式细胞术评估细胞活化分子、抑制性分子和细胞功能。电化学发光法检测血清中IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α浓度。【结果】结核患者体内IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α分泌均显著高于健康对照。结核患者效应细胞功能总体呈现减弱趋势,包括CD4+、CD8+、NK、DC、Mon。然而,调节T细胞(Tregs)以及结核特异性的CD4+、CD8+和NK细胞功能显著增强。CTLA-4、TIM-3、TIGIT、PD-1在结核患者CD4+、CD8+、NK和Tregs表达显著高于健康志愿者。【结论】结核患者免疫功能变化涉及多种炎症因子、细胞和分子,呈异质性。结核患者细胞功能失衡,效应细胞功能明显减弱,抑制性细胞功能增强。【目的】研究TIGIT如何影响活动性结核中调节性T和效应T细胞的作用及机制。【方法】纳入85例健康志愿者和52例结核患者,使用流式细胞仪检测TIGIT的表达与Tregs和CD4+效应细胞(Teffs)细胞活化、增殖的关系。使用TIGIT Fc融合蛋白或CD155融合蛋白或对照Ig G与结核患者PBMCs共同孵育,观察封闭或激活TIGIT信号通路后对Tregs和Teffs细胞活化、分泌细胞因子的能力及增殖功能的影响。最后,阻断CD4+T细胞的TIGIT信号通路,观察巨噬细胞控制Mtb生长的能力【结果】结核患者TIGIT在Tregs上高表达且与Tregs的活化和功能正相关。单独阻断TIGIT信号通路可以降低Tregs的功能,包括IL-10的分泌和增殖功能,而对Teffs功能没有作用。尽管阻断TIGIT对Teffs没有影响,封闭TIM-3信号通路可以恢复Teffs功能。此外,阻断CD4+T细胞的TIGIT途径增强了巨噬细胞控制Mtb生长的能力。【结论】CD4+T细胞上表达的TIGIT很可能主要通过Tregs而不是Teffs在结核感染中发挥作用。【目的】研究抑制性分子对T-SPOT结果的影响。【方法】纳入32例健康志愿者、24例结核T-SPOT高反应(TBAg/PHA≥0.3)和20例结核T-SPOT假阴性/低值(TBAg/PHA0.3)患者,收集新鲜外周血,使用流式细胞仪检测CD4+、CD8+和NK细胞功能和TIM-3、PD-1的表达。在结核T-SPOT假阴性/低值PBMCs中加入TIM-3和PD-1封闭抗体共同孵育,观察封闭信号通路后对T-SPOT结果的影响。【结果】结核患者非特异性CD4+、CD8+和NK细胞功能均显著低于健康对照,T-SPOT高反应患者与T-SPOT低反应患者无差别。然而,T-SPOT高反应患者结核特异性CD4+、CD8+和NK细胞功能强于T-SPOT假阴性/低值患者。T-SPOT假阴性/低值组CD8+PD-1+、NK PD-1+和NK TIM-3+的表达显著高于T-SPOT高反应性患者。联合封闭TIM-3和PD-1信号通路均可部分提高IFN-γ分泌水平和T-SPOT斑点计数。【结论】TIM-3和PD-1的过表达可导致T-SPOT假阴性/低值,封闭TIM-3和PD-1信号通路可以部分纠正T-SPOT假阴性和低比值,提高T-SPOT准确性。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R52
【图文】：

血清,结核,肺外结核,炎症因子

数据分析和作图使用GraphPad软件，两组间的比较采用Mann Whitney U检验。P< 0.05 具有统计学差异（*P < 0.05)。结果1. 纳入研究对象的基本特征本部分纳入 61 例研究者，包括 23 例健康对照和 38 例结核患者。研究对象的平均年龄分别为：健康对照 38.6 岁（23-63），结核组 51.0 岁（18-78）。健康组男性占比为 69.5%，结核组男性占比 65.7%。结核组包括 29 例肺结核患者和 9 例肺外结核患者，肺外结核包括肠结核、肾结核、肝脏结核和结核性腹膜炎。2. 结核患者炎症因子水平显著高于健康对照为了评价结核患者体内炎症水平的改变，血清中的 10 种炎症因子用于检测。结果发现结核患者体内 TNF- 、IL-8、IL-6、IL-1β、IL-12p70、IL-4、IL-2、IL-13、IL-10、IFN-γ 浓度均显著高于健康对照，说明结核活动时机体呈现免疫激活的状态。

患者,结核,NK细胞,细胞分泌

+和 NK 细胞分泌 IFN-γ、IL-2和TNF- 能力显现不同程度的下降（图2.a）。NK细胞表面CD107a表达显著减少，表明NK细胞脱颗粒能力降低（图2.b）。此外，结核患者Mon和DC细胞分泌TNF-能力明显减弱（图 2.c）。然而，具有抑制性功能的 Tregs 细胞分泌 IL-10 的能力增强，说明结核患者 Tregs 分泌功能增强（图 2.d）。图 2.结核患者非特异性免疫功能评估。从 ATB（n=23）和 HC（n=20）中收集外周血细胞，流式细胞术检测不同免疫细胞的功能。（a）IFN-γ、TNF- 、IL-2、IFN-γ+TNF-+、IFN-γ+IL-2+和 IL-2+TNF-+在 CD4+、CD8+和 NK 细胞上的表达水平（LeukoAct Cktl With GolgiPlug 刺激）。（b）CD107a 在 CD8+和 NK 细胞上的表达（LeukoAct Cktl With GolgiPlug 刺激）。（c）TNF-在 DC 和单核细胞（Mon）上的表达水平（LPS 刺激）（。d）Tregs 分泌 IL-10 的百分比（aCD3/CD28刺激）。结果表示为 mean±SD。* P <0.05，均代表结核组与对照组比较（Mann-Whitney U-检验）。4. 结核患者的结核特异性细胞活化增强且功能增强我们进一步检测结核特异性的细胞功能，结果表明结核特异性的 CD4+、CD8+和 NK 细胞活性显著增强（图 3.a）。此外

细胞功能,结核,特异性,抑制性

图 3. 结核患者的细胞活化和结核特异性细胞功能。从 ATB（n=23）和 HC（n=20）中收周血单个核细胞，流式细胞术检测（a）HLA-DR 在 CD4+、CD8+和 NK 细胞上的表达百（ESAT-6/CFP-10 刺激）。（b）IFN-γ 在 CD4+、CD8+和 NK 细胞上的表达百分比（ESAT-6/CF刺激）。结果表示为 mean±SD。* P <0.05，均代表结核组与对照组比较（Mann-Whitney U验）。5. 结核患者抑制性分子在不同细胞上表达升高为研究抑制性分子在结核中的作用，该研究还检测了 CTLA-4、TIM-3、TIGPD-1 在不同细胞上的表达。结核患者 CTLA-4 在 CD4+、CD8+和 NK 细胞表达分比均显著高于健康对照（图 4.a）。TIM-3 在 CD4+、CD8+、NK 细胞和 Treg的表达显著增强（图 4.b）。结核患者 TIGIT 在 CD4+和 Tregs 表达百分比均明显于健康对照（图 4.c）。PD-1 在 CD4+、CD8+、NK 细胞和 Tregs 的表达均显著升（图 4.d）。以上说明，在结核患者中抑制性分子均在不同细胞水平上上调，暗

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