【摘要】：目的利用巢式PCR反应的敏感性、特异性和准确性等特点,选取大理地区白族人群和鼠为调查对象,对毕氏微孢子虫和隐孢子虫的感染情况进行调查;研究白族人群和鼠感染的毕氏微孢子虫是否存在人兽共患基因型,以及白族人群和鼠感染的隐孢子虫种类,为今后微孢子病和隐孢子虫病的进一步研究提供参考。方法从2016年4月至2017年7月,在大理市周边及村庄共采集599份白族人群粪便样本和287份鼠粪便样本,用OMG试剂盒提取粪便样本DNA。基于微孢子虫内转录间隔区(ITS)序列和隐孢子虫的核糖体小亚基(SSU rRNA)基因中的多态区,应用巢式PCR方法扩增粪便样本DNA,把成功扩增到条带的样本测序,确定阳性率。在NCBI序列库进行同源序列搜索,并应用Cluster X 1.83、SPSS19.0和MEGA6等分子生物学软件进行序列比对、分析和建树,确定虫种、基因型及流行规律。结果1.在大理地区采集到的599份白族人群粪便样本中,经巢式PCR扩增、测序后检测出12份阳性样本,毕氏微孢子虫的感染率为2.00%(12/599,95%CI0.88~3.13)。其中男性感染率为2.91%(8/275,95%CI 0.92~4.90),女性感染率为1.24%(4/324,95%CI 0.03~2.44),男女两组感染率差异无统计学意义(P=0.15)。18岁以下的人群组无毕氏微孢子虫感染,18~40岁人群中有2人感染,感染率为1.36%(2/147,95%CI 0.00~3.23);在41~65岁的304人中有7人感染毕氏微孢子虫,感染率为2.30%(7/304,95%CI 0.62~3.99);在65岁以上人群中有3人感染毕氏微孢子虫,感染率为3.49%(3/86,95%CI 0.00~7.37);年龄组之间感染率差异无统计学意义(P=0.44)。农村居民毕氏微孢子虫感染率(2.97%,11/370,95%CI 1.24~4.70)显著高于城镇人群感染率(0.44%,1/229,95%CI 0.00~1.29),差异具有统计学意义(P0.05)。12份阳性样本中鉴定出4种已知基因型:EbpC(n=5)、SC02(n=1)、Henan-Ⅳ(n=2)和D(n=1);3种新基因型,分别命名为Yunnan1,Yunnan2和Yunnan3。2.在采集到的287份鼠粪便样本中共检测出12份毕氏微孢子虫阳性样本,感染率为4.18%(12/287,95%CI 1.87~6.50)。其中褐家鼠感染率为4.44%(12/270),黄胸鼠感染率为0(0/17)。幼年组感染率为12.50%(2/16,95%CI 0.00~28.70),少年组感染率为1.37%(1/73,95%CI 0.00~4.04),成年组感染率为4.55%(9/198,95%CI 1.64~7.45),差异无统计学意义(P0.05)。雌性感染率为4.57%(8/175,95%CI 1.48~7.67),雄性感染率3.57%(4/112,95%CI 0.13~7.00),差异无统计学意义。鼠粪便样本中除了发现与人群粪便中相同的基因型D和EbpC外,还有一种新基因型,命名为YNM1。3.白族人群隐孢子虫的研究中仅检测出1份阳性样本,感染率为0.17%(1/599),为鼠隐孢子虫(Cryptosporidium muris)。4.鼠粪便样本中检测出13份隐孢子虫阳性样本,全为鼠隐孢子虫,感染率为4.53%(13/287,95%CI 2.12~6.94)。幼年组感染率(31.25%,5/16,95%CI8.54~53.96)显著高于少年组(6.85%,5/73,95%CI 1.06~12.64)和成年组(1.52%,3/198,95%CI 0.00~3.22),年龄段是鼠感染隐孢子虫的重要风险因素,差异有统计学意义(P0.001)。雌性感染率为6.29%(11/175,95%CI 2.69~9.88),雄性感染率为1.79%(2/112,95%CI 0.00~4.24),差异无统计学意义(P0.05)。有一幼年鼠既感染毕氏微孢子虫,也感染隐孢子虫。结论本研究首次解析了大理地区白族人群及鼠毕氏微孢子虫的人兽共患基因型和隐孢子虫的种类。白族人群毕氏微孢子虫感染率为2.00%,隐孢子虫感染率为0.17%;鼠毕氏微孢子虫感染率为4.18%,隐孢子虫感染率为4.53%。成功鉴定出毕氏微孢子虫基因型:EbpC、SC02、Henan-Ⅳ、D、Yunnan1、Yunnan2、Yunnan3和YNM1;发现鼠粪便样本中有与人群粪便样本相同的基因型:D和EbpC;其中Yunnan1、Yunnan2、Yunnan3和YNM1是本次研究鉴定出的新型。人和鼠感染的隐孢子虫都为鼠隐孢子虫(C.muris)。
【学位授予单位】：大理大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R531.5;R181.81
【图文】：
图 1. 微孢子虫进化地位研究的变迁[10]Figure 1. Changes in the evolutionary status of Microsporidium随着近几年分子生物学技术的发展，除了传统的生物学分类方法，现如进化和种系发育分析上，用来鉴定和分类的基因有 SSUrRNA 基因的内转录
图 3. 中国西南地区云南省大理地区调查地点图Figure 3. The investigation site of Dali BaiAutonomous Prefecture, Yunnan Province, SouthwestChina
基于巢式 PCR 方法检测，在白族人群 599 份粪便样品中成功扩增出 12 份阳性样本，条带大小约为 390bp（如图 4 所示）。图4. 人群粪便样本中毕氏微孢子虫PCR扩增结果Figure 4. The PCR amplification of E.bieneusi in faecal samples of people
【参考文献】
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2773223
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