葡萄糖代谢调控在黑色素瘤及尖锐湿疣发病中的作用及机制研究

发布时间：2020-08-01 12:31

【摘要】：第一部分 FAH在黑色素瘤细胞中的表达及其对代谢重编程的调控及机制研究目的:本研究旨在探究黑色素瘤细胞中FAH的表达及其对代谢重编程的调控作用,首先探讨FAH是否影响黑素瘤患者及荷瘤小鼠的生存期,进一步研究FAH在黑色素瘤细胞水平所发挥的作用及其内在机制。在细胞水平的研究主要集中在FAH对黑色素瘤细胞增殖、细胞周期及凋亡等生物学功能的影响及机制,而其中FAH作用的通路学研究的重点为FAH对TCA循环的回补反应及对其他代谢途径如糖代谢、核苷酸及脂肪酸合成代谢等通路的影响。同时也进一步探究促进FAH在黑色素瘤细胞中表达的因素,其中重点研究CDC5L蛋白的促进作用。通过上述研究,有助于更深入的理解黑色素瘤代谢重编程的特征及其中FAH所发挥的作用,同时也为FAH成为一种新型的黑色素瘤的治疗靶点及预后指标提供理论依据。方法:(1)采用含有100例人黑色素瘤及良性色素痣的组织芯片,使用免疫组化技术检测胞内FAH蛋白的含量。从Oncomine数据库中分析两组包括黑色素瘤、良性色素痣及正常皮肤组织的数百例人类标本中FAH的mRNA表达量的数据集;(2)从TCGA数据库中提取278例黑色素瘤患者的详细信息,Kaplan-Meier生存分析其中肿瘤组织FAH的表达量与患者总生存率(OS)及无疾病生存率(DFS)的关系。使用慢病毒转染技术分别构建FAH基因稳定缺陷及表达正常的人黑色素瘤细胞系,并建立荷瘤小鼠模型。比较正常表达FAH基因的黑色素瘤细胞与FAH缺陷的黑色素瘤细胞所构建的荷瘤小鼠的生存时间变化;(3)用siRNA沉默FAH表达或用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,研究人黑色素瘤细胞系A375、A875及SK-MEL-1的细胞增殖、细胞周期及凋亡情况;(4)用siRNA沉默FAH表达后,使用mRNA表达谱芯片研究A375细胞系的全转录组mRNA变化,并进行GO分析、Pathway分析及Pathway-net的构建,分析其中的关键细胞功能及通路的变化;(5)采用共聚焦显微镜、Western blot分析人黑色素瘤细胞系中的FAH及延胡索酸酶(FH)的表达及亚细胞定位;(6)筛选siRNA沉默FAH表达后的A375细胞的mRNA表达谱芯片数据,分析酪氨酸代谢从FAH到TCA循环的代谢流中的各相关酶及转运子的mRNA表达变化。用siRNA沉默FAH表达或用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,采用试剂盒检测人黑色素瘤细胞中的延胡索酸含量,并用Real-time RT-PCR及Western blot验证A375细胞中酪氨酸代谢从FAH到TCA循环的代谢流中的各相关酶及转运子的变化;(7)从TCGA数据库中提取278例黑色素瘤患者的详细信息,分析其中肿瘤组织FAH的表达量与TCA循环中各个酶的表达量的相关性。筛选siRNA沉默FAH表达后的A375细胞系的mRNA表达谱芯片数据,分析TCA循环中各个酶的mRNA表达变化。再用siRNA沉默FAH表达或用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot验证A375细胞中TCA循环中各限速酶的变化,同时采用~(13)C-D-glucose同位素示踪技术分析其中的代谢流方向;(8)筛选siRNA沉默FAH表达后的A375细胞系的mRNA表达谱芯片数据,分析柠檬酸来源的脂肪酸合成中各相关酶的mRNA表达变化。再用siRNA沉默FAH表达或用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot验证A375细胞中柠檬酸来源的脂肪酸合成中各相关酶的变化;(9)筛选siRNA沉默FAH表达后的A375细胞系的mRNA表达谱芯片数据,分析葡萄糖转运子及糖酵解、磷酸戊糖途径及核苷酸合成中各相关酶的mRNA表达变化。再用siRNA沉默FAH表达或用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,采用Real-time RT-PCR及Western blot验证A375细胞中葡萄糖转运子及糖酵解、磷酸戊糖途径及核苷酸合成中各限速酶变化,同时采用~(13)C-D-glucose同位素示踪技术分析糖酵解的代谢流方向;(10)用siRNA沉默FAH表达或用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,采用葡萄糖检测试剂盒检测A375细胞的葡萄糖消耗率变化;(11)检索SABiosciences数据库,寻找CDC5L蛋白在FAH基因转录起始点上游的结合位点及序列,构建带HA标签的CDC5L高表达质粒(pCMV-C-HA-CDC5L-CDS)后转染A375细胞,后通过染色质免疫共沉淀(ChIP)及Real-time PCR验证CDC5L蛋白是否与FAH基因转录起始点上游的预测结合位点有效结合,并进一步通过siRNA沉默CDC5L表达后采用Real-time RT-PCR及Western blot验证FAH的表达变化。结果:(1)人黑色素瘤细胞中的FAH表达在蛋白及mRNA水平均明显高于良性色素痣细胞;(2)临床黑色素瘤患者的总生存率(OS)及无疾病生存率(DFS)与FAH表达量呈明显负相关,即FAH高表达的患者生存期明显缩短。同时FAH缺陷的人黑色素瘤细胞接种裸鼠后,荷瘤小鼠的生存时间较正常组明显延长;(3)用siRNA抑制FAH表达后,人黑色素瘤细胞的增殖减少、凋亡增加并且细胞周期G1期明显延长、G2+S期明显缩短。此外用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,人黑色素瘤细胞增殖与凋亡未见明显变化,但细胞周期G1期稍缩短且G2+S期稍延长;(4)用siRNA沉默A375细胞中的FAH表达后,对其进行mRNA表达谱芯片实验并进行后续的生物信息学分析,其中GO分析显示小分子代谢、细胞周期阻滞、细胞增殖、凋亡、细胞迁移、TCA循环及生物合成等功能学聚类出现明显富集。与GO分析一致,Pathway分析显示代谢通路、细胞周期、凋亡、HIF-1信号通路、TCA循环、酪氨酸及苯丙氨酸代谢等通路学聚类也出现明显富集;(5)共聚焦显微镜及Western blot分析显示人黑色素瘤细胞中FAH主要定位于细胞质,而不是线粒体中。而延胡索酸酶(FH)则在线粒体及胞质内均有分布;(6)用siRNA沉默FAH表达后,人黑色素瘤细胞中的延胡索酸含量明显下降;与此一致,用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,人黑色素瘤细胞中的延胡索酸含量增加。经siRNA沉默FAH表达后的A375细胞的mRNA表达谱芯片结果显示,酪氨酸代谢从FAH到TCA循环的代谢流中的各相关酶及转运子的mRNA表达均下降。进一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot验证A375细胞中上述各相关酶及转运子在FAH消减后表达明显下降,而在FAH高表达后表达稍增加;(7)对来自TCGA数据库的278例黑色素瘤患者的数据分析显示,患者肿瘤组织FAH的表达量与其TCA循环中各个酶的表达量都呈现出明显的正相关性。经siRNA沉默FAH表达后的A375细胞的mRNA表达谱芯片结果显示,TCA循环的各个酶的mRNA表达均下降。进一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot验证A375细胞中TCA循环的各限速酶在FAH消减后表达明显下降,而在FAH高表达后表达稍增加,同时用~(13)C-D-glucose同位素示踪技术分析显示FAH消减后TCA循环的代谢流明显减速,而在FAH高表达后代谢流无明显变化;(8)经siRNA沉默FAH表达后的A375细胞的mRNA表达谱芯片结果显示,柠檬酸来源的脂肪酸合成代谢中的各相关酶的mRNA表达均下降。进一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot验证A375细胞中柠檬酸来源的脂肪酸合成中各相关酶在FAH消减后表达明显下降,而在FAH高表达后表达稍增加;(9)经siRNA沉默FAH表达后的A375细胞的mRNA表达谱芯片结果显示,葡萄糖转运子、糖酵解、磷酸戊糖途径及核苷酸合成中各相关酶的mRNA表达均下降。进一步用siRNA沉默或FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后,Real-time RT-PCR及Western blot验证A375细胞中葡萄糖转运子、糖酵解、磷酸戊糖途径及核苷酸合成中各限速酶在FAH消减后表达明显下降,而在FAH高表达后表达稍增加;同时用~(13)C-D-glucose同位素示踪技术分析显示FAH消减后糖酵解代谢流减慢,而在FAH高表达后代谢流无明显变化;(10)用siRNA沉默FAH表达后A375细胞的葡萄糖消耗率降低,而用FAH-pcDNA3.1质粒高表达FAH后A375细胞的葡萄糖消耗率无明显变化;(11)ChIP-qPCR证明CDC5L蛋白可以有效结合FAH基因转录起始点上游的预测结合位点,并且用siRNA沉默CDC5L表达后人黑色素瘤细胞中的FAH的表达量也明显下降。结论:在本研究中,我们的结果证实在黑色素瘤的发生发展中,肿瘤细胞内CDC5L可有效促进FAH的高表达,后者可以有效地促进TCA循环中的回补反应,从而促进TCA循环的代谢流加速。此外,FAH也能促进黑色素瘤细胞对葡萄糖的消耗并加速糖酵解、磷酸戊糖途径、核苷酸合成及柠檬酸来源的脂肪酸合成等通路的代谢流。而这些代谢通路均是生物合成及能量代谢的重要组成部分,对于维持黑色素瘤细胞的内稳态、生存与发展极其重要。与此一致,我们的研究证明FAH的高表达可明显影响黑色素瘤细胞的多种生物学功能,如促进细胞增殖及葡萄糖消耗、促进细胞周期进展并抑制凋亡等,同时我们还发现FAH的表达与黑色素瘤患者及荷瘤小鼠的生存时间呈明显负相关。综上所述,我们推测FAH可能是黑色素瘤发生发展中的一个重要的促瘤因子,并有可能成为黑色素瘤防治中的一个重要的靶点及独立的预后指标。然而,对于实验中所出现的对FAH通过质粒转染而进一步升高其表达,却未对黑色素瘤细胞的生物学功能产生明显影响的原因,我们推测可能是与黑色素瘤本身已经存在高表达的FAH与其作用底物有限有关。FAH在黑色素瘤细胞中的代谢反应可能已趋向饱和,而此时即使再进一步升高FAH的表达,也可能无法有效诱发细胞整体水平的功能学改变,但其中的具体原因我们在后续研究中还将继续探讨。本文对FAH的研究也可为阐明黑色素瘤发生发展中的深层次代谢学变化提供新的思路,并可为此类肿瘤的治疗提供新的靶点。第二部分缺氧诱导的糖原代谢在尖锐湿疣发病中的变化及作用研究目的:本研究旨在探讨在尖锐湿疣(Condylomata acuminata,CA)发生发展的过程中,其疣体内的角质形成细胞所发生的糖代谢学变化,其中重点关注糖原代谢所发挥的作用及调控机制,同时也探讨CA疣体中的局部氧浓度变化及对糖原代谢的影响。我们首先收集CA患者的疣体及正常人的包皮组织,然后通过m RNA表达谱芯片研究两种组织中的角质形成细胞的全转录组的表达变化,以此预测在CA发生发展过程中疣体内的角质形成细胞所发生的关键基因、功能及通路变化。再通过对上述疣体及正常包皮中的角质形成细胞进行PCR、Western blot和免疫组化等分析,来进一步验证其中的糖代谢特征,其中重点关注糖原代谢和糖酵解的变化,同时也研究TCA循环、磷酸戊糖途径及核苷酸合成等代谢途径的变化。随后,通过进一步研究CA组织中的糖原水平及糖原合酶GYS1对人角质形成细胞系的影响,来探讨CA发生发展中角质形成细胞发生的糖原代谢的变化及其影响。同时也通过多种分子生物学技术来探讨CA皮损中是否存在局部缺氧改变,以及缺氧是否可影响其中的糖原代谢。通过上述研究,我们希望有利于进一步理解CA发生发展中的糖代谢学特征及其影响,也为开发新型的CA防控策略提供新的思路。方法:(1)经同济医院临床研究伦理委员会批准同意并获得了患者及志愿者知情同意后,我们收集了46例在同济医院门诊就诊的青年男性CA患者的包皮处疣体。并同时收集了32例青年男性健康志愿者经包皮环切术取下的正常包皮作为正常对照。然后分别取出疣体及包皮组织中的角质形成细胞后进行m RNA表达谱芯片分析,后续进行了GO分析、Pathway分析、Pathway-net和Signal-net的构建等生物信息学分析来探究其中的关键基因、功能及通路变化;(2)筛选CA及正常包皮组织的角质形成细胞的m RNA表达谱芯片数据,分析TCA循环中各个酶的m RNA表达变化,再对数十例临床CA患者的疣体组织及正常志愿者的包皮组织的角质形成细胞进行Real-time RT-PCR分析进一步验证芯片结果;(3)筛选CA及正常包皮组织的角质形成细胞的m RNA表达谱芯片数据,分析葡萄糖转运、糖酵解、磷酸戊糖途径及核苷酸合成中各相关酶的m RNA表达变化,再对数十例临床CA患者的疣体组织及正常志愿者的包皮组织的角质形成细胞进行Real-time RT-PCR分析进一步验证芯片结果;(4)筛选CA及正常包皮组织的角质形成细胞的m RNA表达谱芯片数据,分析糖原代谢各关键酶的m RNA表达变化,再对数十例临床CA患者的疣体组织及正常志愿者的包皮组织的角质形成细胞进行Real-time RT-PCR分析进一步验证芯片结果;(5)使用si RNA沉默人角质形成细胞系Ha Ca T细胞中的GYS1表达后,分别在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)环境下培养48h,后通过细胞增殖相关指标Ki-67进行流式分析细胞增殖的情况,同时用凋亡指标Annexin/PI染色后流式分析细胞凋亡的情况;(6)筛选CA及正常包皮组织的角质形成细胞的m RNA表达谱芯片数据,分析缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、碳酸酐酶-9(CA-9)等的m RNA表达变化。再用HIF-1α免疫组化染色CA组织及正常包皮组织,以进一步确定其中角质形成细胞的缺氧情况。进一步用PAS染色、CA-9免疫组化染色及二者共染色来判断CA组织及正常包皮组织中角质形成细胞内的糖原含量、缺氧情况及缺氧与糖原表达的关系;(7)将Ha Ca T细胞按不同时间点分别在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)环境下培养,后通过PAS染色判断其中的糖原含量。结果:(1)CA疣体及正常包皮组织的角质形成细胞m RNA表达谱芯片结果显示,GO分析中细胞周期、小分子代谢、凋亡、细胞对缺氧的反应、葡萄糖代谢及转运、脂类代谢、核苷酸代谢及角质形成细胞增殖等功能学聚类出现明显富集。与GO分析一致,Pathway分析显示代谢通路、细胞周期、HIF-1信号通路、嘌呤及嘧啶代谢、糖酵解/糖异生及脂类代谢等通路也出现明显富集;Singal-net也显示出在CA疣体角质形成细胞中的HK2、HIF-1Α、LDHA、SLC2A1等代谢基因的表达较正常组明显上调,提示这些基因可能是CA发生发展过程中起主要调节作用的核心代谢基因;(2)CA疣体及正常包皮组织的角质形成细胞m RNA表达谱芯片结果显示TCA循环中各个酶的表达无明显变化,临床CA疣体及正常包皮组织中角质形成细胞的Real-time RT-PCR结果与芯片结果一致,TCA循环中各限速酶的表达在m RNA水平均无明显变化;(3)CA疣体及正常包皮组织的角质形成细胞m RNA表达谱芯片结果显示葡萄糖转运子及糖酵解、磷酸戊糖途径及核苷酸合成中各限速酶的表达在疣体中明显高于正常。临床CA疣体及正常包皮组织中角质形成细胞的Real-time RT-PCR结果与芯片结果一致;(4)CA疣体及正常包皮组织的角质形成细胞m RNA表达谱芯片结果显示糖原代谢各关键酶的表达在疣体中明显高于正常包皮组织,临床CA疣体及正常包皮组织中角质形成细胞的Real-time RT-PCR结果与芯片结果一致;(5)GYS1沉默后的Ha Ca T细胞在常氧(20%O2)及缺氧(1%O2)培养下均呈现出Ki-67表达减少,并且凋亡细胞数增加;(6)CA疣体及正常包皮组织的角质形成细胞m RNA表达谱芯片结果显示疣体中HIF-1α和CA-9的表达较正常包皮组织明显升高。HIF-1α免疫组化染色也证明CA疣体组织角质形成细胞的表达明显高于正常包皮组织。同时PAS染色显示CA疣体组织角质形成细胞中的糖原含量明显高于正常包皮组织,CA-9免疫组化染色显示CA疣体组织角质形成细胞的表达也明显高于正常包皮组织,并且共染色实验证明PAS阳性区与CA-9阳性区呈现共定位表达;(7)Ha Ca T细胞在缺氧(1%O2)环境下培养时,PAS染色阳性率较常氧(20%O2)培养时均增高,尤其在缺氧培养48h时阳性率最高。结论:本研究中,我们发现CA疣体在发生发展的过程中,受病毒感染的角质形成细胞会出现局域性缺氧及糖原积累,并且缺氧与糖原积累存在直接关系。同时受感染的角质形成细胞的葡萄糖消耗、糖酵解、磷酸戊糖途径及糖原与核苷酸合成等代谢流均明显增强,而TCA循环的代谢流却没有明显变化。此现象提示受感染的角质形成细胞摄取的葡萄糖更多的流向了糖酵解的分支——磷酸戊糖途径,从而增强了核苷酸的合成,同时也较多的流向了糖原代谢途径而增多了糖原的合成。这些糖代谢途径的改变可能与受感染的角质形成细胞出现的局域性缺氧有关,已有多项报道指出缺氧可诱导GYS1的表达而有利于糖原积累,而增加的糖原又对维持缺氧状态下的细胞生存至关重要。因而,这些代谢学改变可为阐明CA发生发展中局部氧含量及相关代谢学的变化,以及糖原积累的作用提供理论依据,并有利于寻找关键的CA代谢学防治靶点。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5;R752.53
【图文】：

中高,人黑色素瘤,黑素瘤,免疫组化分析

48FAH 在人黑色素瘤细胞中高表达。A，免疫组化分析人黑色素瘤组织芯达情况。 B，将上述免疫组化检测 FAH 表达的人黑素瘤组织芯片中的度分析，分析采用 IPP6.0 软件，并选用其中的代表性标本。数据表示值; 误差线代表 SEM; *** 代表 P<0.001（Student's t-检验）。 C，分ine 数据库中的两个不同数据集（Haqq 和 Talantov）的黑色素瘤、色素

黑素瘤,荷瘤小鼠,负相关,患者

2. FAH 表达与黑素瘤患者和荷瘤小鼠的生存期呈负相关。A-C, 通过用 shFAH 或慢病毒进行转染及后续嘌呤霉素筛选，从而构建出 FAH 稳定消减的 A375 和 A8胞。转染效率通过荧光显微镜检测 GFP 表达（A）、real-time RT-PCR（B）和 westlot（C）进行验证。D，对接种 FAH 稳定敲除的或表达正常的黑色素瘤细胞所构的 BALB/c-裸鼠模型进行生存分析。数据表示为平均值±SEM; n = 8; * 代<0.05 ， *** 代表 P<0.001（Student's t-检验）。 E，使用 SPSS17.0 软件分析来CGA 数据库的 278 名黑色素瘤患者的总生存率（OS）、无疾病生存率（DFS）及与 FAH 的 mRNA 值的关系。igure 2. FAH expression is inversely associated with survival in both melanoma patiend melanoma-bearing mice. A-C. Stable FAH knockdown in A375 and A875 cells wchieved by transduction with shFAH or control lentivirus followed by puromycin selectransduction efficiency was verified by GFP detection using fluorescence microscopy (

黑色素瘤,转染,底物,小干扰

在黑色素瘤中高表达的 FAH 与临床黑色素瘤患者及荷瘤小鼠的生存密切相关。为了进一步研究 FAH 对黑色素瘤细胞生物学功能的影响，我们首先了 FAH 对人黑色素瘤细胞增殖的影响。我们通过小干扰 RNA（siRNA）及高表粒分别转染人黑色素瘤细胞系，使细胞中的 FAH 沉默或高表达，并且转染效率用 Real-time RT-PCR 和 Western blot 进行验证（图 3A 和 3B）。由于 A875 细胞无受高表达质粒的转染，因而我们只做了其他两种人黑色素瘤细胞系 A375K-MEL-1 的高表达质粒转染实验。增殖结果如图 3C 和 3D 所示，在三种人黑色素胞系中沉默 FAH 的表达后，其增殖能力均明显下降，提示 FAH 对人黑色素瘤细增殖是十分重要的。然而高表达人黑色素瘤细胞系中的 FAH 后，其增殖能力却现明显改变。我们推测这个现象可能与人黑色素瘤细胞本身就已经存在明显高表 FAH 有关。因为细胞内 FAH 的作用底物是有限的，而黑色素瘤细胞自身高表达H 的对有限的作用底物的反应可能已经趋于饱和，此时即使再进一步升高 FAH达，也可能无法进一步诱发细胞整体水平的明显增殖改变。

【参考文献】