重组结核分枝杆菌TB10.4诊断结核病的研究
发布时间：2020-08-18 20:46
【摘要】：目的:克隆和表达结核分枝杆菌TB10.4,分析TB10.4的免疫学活性,构建基于TB10.4的纳米金生物传感器,评价其诊断结核病的能力,为结核病的诊断提供新的实验依据。方法:根据GenBank中结核分枝杆菌标准株H37Rv的TB10.4基因序列设计引物,采用聚合酶链反应从H37Rv基因组DNA中扩增目的基因TB10.4,克隆至pMD-18T载体,转化大肠埃希菌JM109,筛选并鉴定阳性克隆,并予测序分析;将TB10.4基因插入原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠埃希菌E.coliDH5α,PCR和双酶切鉴定阳性重组体;将重组子转化大肠埃希菌BL21,大量诱导表达TB10.4蛋白,冰浴超声裂解菌体,His-bindTM柱层析纯化TB10.4蛋白。免疫印迹分析TB10.4蛋白的免疫活性,酶联免疫吸附测定评价其对于结核病的诊断价值。采用晶种生长法制备金纳米棒,经1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、十一巯基十一烷酸(MUA)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的化学修饰后,经目的蛋白TB10.4修饰,制备纳米金生物传感器,评价其对于结核病的诊断能力。结果:PCR扩增和克隆获得TB10.4基因片段,大小约300 bp,与GenBank中报道的序列一致。将TB10.4基因片段插入原核表达载体,构建了 TB10.4蛋白的重组表达质粒,金属螯合层析获得了分子量约为10.4kDa的TB10.4。免疫印迹证实TB10.4可与结核患者血清中特异性抗体反应。酶联免疫吸附测定对于结核患者血清诊断的灵敏度为88.5%,特异度为97.3%,阳性预测值93.8%,阴性预测值94.8%,诊断效率达94.5%。种子生长法制备了分散度较好的金纳米棒,构建了基于TB10.4的纳米金生物传感器,其血清学诊断的灵敏度、特异性和诊断效率分别为96.2%、92.0%、93.3%。结论:成功构建了 TB10.4蛋白的重组表达质粒,表达的TB10.4蛋白具有较强的免疫反应性,基于TB10.4的纳米金生物传感器可用于诊断结核病。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R52
【图文】：
３结果逡逑３．邋１目的基因ＴＢ１０．邋４的扩增逡逑ＰＣＲ扩增目的基因的电泳图谱如图１。由图１可知，ＰＣＲ技术获得了约为逡逑３００ｂｐ邋的邋ＴＢ１０．４邋基因。逡逑ｖ邋，逦．．逦Ｍ邋Ｍ邋１邋＾邋＾逡逑雇ｆｅ．逡逑两＇—〗？－逡逑…W 逡逑图１邋ＴＢ１０．４基因的扩增逦图２ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４的菌落ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋；邋１：邋ＴＢ１０．４邋；逦Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒ邋；邋１：阴性对照；逡逑２：阴性对照逦２－６：邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４的菌落ＰＣＲ产物逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋ＴＢ邋１０．４逦Ｆｉｇ．２邋ｃｏｌｏｎｙ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４逡逑Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒ邋；邋１：邋ＴＢ１０．４逦Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋１邋：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｒｏｌ逡逑２：Ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逦２－６：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＴＢ邋１０．４邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｌｏｎｙ逡逑３．２邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４阳性克隆的筛选与鉴定逡逑ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４阳性克隆的鉴定图谱如图２，由图２可知，阳性菌落ＰＣＲ逡逑获得了约为３００ｂｐ的片段。经测序分析与目标序列一致。逡逑３．邋３重组质粒ＰＥＴ－２８ａ邋（＋）－ＴＢ１０．邋４的酶切鉴定逡逑重组表达质粒的双酶切（Ｂ＿ＨＩ和Ｈｆ／７ｄ邋ＩＩＩ）和菌落ＰＣＲ图谱如图３所示，逡逑由图３可知，双酶切和菌落ＰＣＲ均获得约为３００ｂｐ的片段。逡逑２０逡逑
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本文编号：2796698
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R52
【图文】：
３结果逡逑３．邋１目的基因ＴＢ１０．邋４的扩增逡逑ＰＣＲ扩增目的基因的电泳图谱如图１。由图１可知，ＰＣＲ技术获得了约为逡逑３００ｂｐ邋的邋ＴＢ１０．４邋基因。逡逑ｖ邋，逦．．逦Ｍ邋Ｍ邋１邋＾邋＾逡逑雇ｆｅ．逡逑两＇—〗？－逡逑…W 逡逑图１邋ＴＢ１０．４基因的扩增逦图２ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４的菌落ＰＣＲ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ邋；邋１：邋ＴＢ１０．４邋；逦Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒ邋；邋１：阴性对照；逡逑２：阴性对照逦２－６：邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４的菌落ＰＣＲ产物逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋ＴＢ邋１０．４逦Ｆｉｇ．２邋ｃｏｌｏｎｙ邋ＰＣＲ邋ｏｆ邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４逡逑Ｍ：邋ＤＮＡｍａｒｋｅｒ邋；邋１：邋ＴＢ１０．４逦Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋１邋：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｒｏｌ逡逑２：Ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逦２－６：邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＴＢ邋１０．４邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｏｌｏｎｙ逡逑３．２邋ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４阳性克隆的筛选与鉴定逡逑ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＢ１０．４阳性克隆的鉴定图谱如图２，由图２可知，阳性菌落ＰＣＲ逡逑获得了约为３００ｂｐ的片段。经测序分析与目标序列一致。逡逑３．邋３重组质粒ＰＥＴ－２８ａ邋（＋）－ＴＢ１０．邋４的酶切鉴定逡逑重组表达质粒的双酶切（Ｂ＿ＨＩ和Ｈｆ／７ｄ邋ＩＩＩ）和菌落ＰＣＲ图谱如图３所示，逡逑由图３可知，双酶切和菌落ＰＣＲ均获得约为３００ｂｐ的片段。逡逑２０逡逑
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本文编号：2796698
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