B.melitensis外膜蛋白Omp25细胞毒性作用的研究

发布时间：2017-03-31 15:01

  本文关键词：B.melitensis外膜蛋白Omp25细胞毒性作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 构建p ET-30a-omp25原核重组质粒,表达并纯化Omp25融合蛋白,分析融合Omp25蛋白诱导小胶质细胞细胞(BV2)TLR4表达变化及分泌促炎细胞因子IL-6、TNF-α及HMGB1的能力,并探讨Omp25蛋白对诱导BV2细胞凋亡的作用。方法 从Genbank获得omp25基因的序列,设计引物,使用PCR技术扩增出Omp25蛋白的基因序列,通过分子克隆技术将该段序列插入到p ET-30a载体中,构建p ET-30a-omp25原核表达载体,以双酶切及测序方法鉴定载体构建是否成功。将构建好的载体转入到Ecoli-BL-21感受态细菌中,诱导表达Omp25蛋白,使用Ni-NTA-agarose在变性条件下纯化蛋白,通过尿素浓度梯度复性法复性纯化后的蛋白。Omp25蛋白分别以不同的浓度作用于BV2细胞,应用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法检测刺激24h后TLR4m RNA的相对表达;ELISA双抗体夹心法分别检测IL-6、TNF-α和HMGB1的产生水平;采用流式细胞术和Annexin V-FITC-PI检测法法观察不同浓度的Omp25蛋白对诱导BV2细胞凋亡作用的影响。采用单因素方差分析进行多组均数的比较,P0.05为差异具有统计学意义。结果 正确克隆omp25基因,并将omp25基因插入到p ET-30a载体中,成功构建了p ET-30a-omp25原核表达载体。重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中成功表达0mp25融合蛋白。以不同浓度融合蛋白刺激BV2后,BV2细胞TLR4 m RNA表达增加,呈现先增高后降低趋势,与对照组对比差异有统计学意义(P0.05)。不同浓度Omp25融合蛋白刺激BV2后,TNF-α的分泌增加,呈现先增高后降低趋势,与对照组对比差异有统计学意义(P0.05),与TLR4表达变化趋势一致。不同浓度Omp25蛋白刺激BV2后,HMGB1的分泌增加,呈现先增高后降低趋势,在5.0μg/ml蛋白浓度刺激下达到最高峰,与对照组对比差异有统计学意义(P0.05)。细胞因子IL-6随蛋白浓度升高呈现逐渐升高的趋势,与对照组对比差异有统计学意义(P0.05)。Omp25蛋白刺激BV2后,会抑制细胞的凋亡。结论 成功获得了Omp25蛋白,Omp25融合蛋白能通过不同浓度诱导BV2细胞TLR4表达上调,分泌较高水平的促炎细胞因子IL-6、TNF-α和HMGB1,TLR4可能介导参与了布鲁氏杆菌侵染中枢神经系统的免疫应答过程。Omp25融合蛋白能抑制BV2细胞发生凋亡。
【关键词】：布鲁氏杆菌 Omp25 小胶质瘤细胞 肿瘤坏死因子-α 高迁移率族蛋白1
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R516.7;R741
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 中英文缩略词表8-11
• 前言11-15
• 材料和方法15-29
• 结果29-45
• 讨论45-49
• 结论49-50
• 参考文献50-53
• 文献综述53-68
• 综述参考文献63-68
• 致谢68-69
• 攻读学位期间发表的学术论文69-70
• 攻读学位期间参与的科研课题70-71
• 攻读学位期间参加的学术会议71

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本文编号：279732