孢子丝菌病病因学分析及发病机理研究
发布时间：2020-08-25 09:29
【摘要】：研究背景孢子丝菌病是由申克孢子丝菌复合体引起的深部真菌感染性疾病。该病病原体为双相真菌,在不同温度条件下可产生不同形态学特征,自然环境中以菌丝相生长,而感染人体后可适应人体37℃体温而转化为酵母相生长。孢子丝菌病除皮肤受累外,致病菌尚可进入淋巴系统并播散全身,引起多系统性损害,严重者可致患者死亡。孢子丝菌病呈全球性分布,在热带及亚热带地区最高发病率可达2.5%,我国东北地区及山东地区为孢子丝菌病的高发地带。孢子丝菌病作为一种机会性感染,由于宿主免疫状态和病原体毒力不同,机体感染孢子丝菌后临床呈不同表型:固定型、皮肤淋巴管型、皮肤播散型和皮肤外型。研究已经证实宿主的遗传素质在机体抵抗病原体感染中发挥重要作用,原发性免疫系统遗传缺陷可影响宿主的免疫状态从而导致不同的临床转归。因此,探讨宿主的遗传素质并从基因水平阐释人类不同个体间感染差异的本质成为当前研究的一个热点。已有研究证实CARD9、MBL2、M4SP2等基因缺陷与多种真菌疾病如暗色丝孢霉病、侵袭性曲霉病等易感相关,而孢子丝菌病是否与先天遗传缺陷相关尚未知。除宿主的遗传素质外,病原菌的形态、数量、毒力因素等也影响到疾病的发展及预后。既往认为申克孢子丝菌是孢子丝菌病的唯一致病菌种,然而近年来分子生物学研究发现孢子丝菌病的致病菌实际为6个菌种组成的复合体:狭义申克孢子丝菌、球形孢子丝菌、巴西孢子丝菌、卢里孢子丝菌、墨西哥孢子丝菌、白孢子丝菌,上述菌种在地理分布、致病能力、毒力强弱、临床表现、药物敏感性等方面均存在差异。明确病原菌具体型别并阐释其毒力因素等对临床疾病的诊疗及预后将有重要指导意义。而当前对我国孢子丝菌的基因分型研究甚少,且国内目前报道以球形孢子丝菌为主。因此对我国不同地区分离的孢子丝菌进行基因分型有助于了解我国孢子丝菌病病原菌的现状,进一步阐释不同型别的致病菌在疾病发生发展中的作用机理,这对临床诊治具有重要意义。基于以上研究背景,本研究主要分以下三部分进行:第一部分61例孢子丝菌病临床特征分析目的分析本院61例孢子丝菌病临床资料,总结该病临床特征。方法回顾性分析本院2015-2017年经真菌培养确诊为孢子丝菌病的患者临床资料,共计61例。统计分析临床特征,包括患者性别、年龄、居住地、发病季节及病程、外伤史、疾病类型及部位、治疗以及真菌检查和病理检查结果。结果61例患者中男性39例(64%),女性22例(36%),年龄分布从31-87岁不等,平均年龄62.81岁;发病季节多见于冬春季节,病程平均2.5月;有明确外伤史者21例(34%);临床分型为固定型35例(57%),皮肤淋巴管型21例(35%),皮肤播散型5例(8%);皮损分布部位从多到少依次为面部23例(38%),手部17例(28%),上肢15例(24%),四肢及背部1例(2%),面部及下肢1例(2%),下肢4例(6%);平均疗程3个月;5例(8%)真菌直接镜检见孢子,33(54%)例组织病理中见真菌孢子,28(46%)例组织病理未见真菌结构呈感染性肉芽肿改变。结论61例孢子丝菌病患者均来自山东地区,临床特征为冬春高发,中老年男性易感且以面部、上肢等暴露部位多见,临床分型以固定型及皮肤淋巴管型多见。第二部分 宿主先天免疫相关基因缺陷及功能研究目的探讨CARD9、MBL2、MASP2基因与孢子丝菌病的相关性,并对发现的遗传基因缺陷进行功能实验验证。方法对61例孢子丝菌病患者及300例非孢子丝菌病患者的外周血提取DNA,采用Sanger测序方法对CARD9、MBL2、MASP2基因进行PCR扩增及测序。统计样本中的基因突变情况,运用费舍尔精确检验分析比较病例组与对照组之间基因变异差异。运用免疫组化及酶联免疫吸附试验(ELISA)分别在病例及对照中对以上基因表达差异进行初步分析。结果CARD9测序结果显示在3名患者中分别发现3个不同的突变位点:c.25GA(p.Glu9Lys),c.820_821insG(p.Asp274Glyfs),c.1118GC(p.Arg373Pro),其中c.25GA为本研究发现的新发基因突变。患者中的变异携带率4.9%(3/61)明显高于本研究中对照人群0%(0/300,P=4.63×10-3,Fisher's exact test)和东亚人群0.09%(4/4291,Exome Aggregation Consortium database,P=8.81×10-5,Fisher's exact test)。MASP2基因测序结果显示在1名患者4号外显子发现1个罕见突变位点:c.477_478insTGCCACAACCAC(CHNH156_159),而在另外匹配的300例对照中(0/300,P=0.169,Fisher's exact test)和东亚人群(0/4290,Exome Aggregation Consortium database,P=0.014,Fisher's exact test)未检测到以上突变位点。此外MASP2中c.464 AG(p.H155R)、c.1111 GT(p.D371Y)、c.1130 TC(p.V377A)、c.1479 CT(p.S493=)以及MBL2基因中c.161GA(p.G54D)在病例与对照中无显著性差异(P0.05,Fisher's Test)。免疫组化结果:与对照相比,CARD9在病例组皮肤组织中高表达,病例组中突变者与未突变者中均有高表达。ELISA结果:MBL和MASP2在病例组血清含量低于对照组血清含量,表达有显著性差异(分别为平均值304 vs 365 ng/ml P=0.002;平均值244 vs 396 ng/ml P=0.022,T test),MASP2突变未影响蛋白表达。结论孢子丝菌病患者群体中CARD9基因及MASP2基因变异率高于对照人群。初步研究显示基因突变未影响蛋白的表达,但突变是否影响蛋白的功能需要进一步实验探索。第三部分 致病菌表型特征、基因分型及药物敏感性研究目的对致病菌进行表型特征、基因分型及体外药物敏感性试验,明确山东地区孢子丝菌病致病菌的菌种类型并为临床用药提供指导。方法(1)菌株形态学鉴定及碳源同化实验:对所有分离菌株接种于沙堡弱培养基(SDA)27℃,并接种脑心浸液琼脂培养基(BHI)37℃,进行双相观察,同时通过酵母氮源基础(YNB)液体培养基检测不同菌株对3种糖(葡萄糖,蔗糖和棉子糖)的同化作用。(2)菌株基因分型:临床分离出的61株孢子丝菌提取菌株DNA,运用Sanger测序方法进行序列分析。利用核糖体内部转录间隔区(ITS)、钙调蛋白(CAL)、部分微管蛋白(β-tubulin)基因序列通用引物进行PCR,并将PCR产物进行电泳跑胶,纯化后上机测序,将测序结果在NCBI数据库及CBS数据库进行比对,应用MEGA5.0分子进化分析软件构建进化树。(3)体外药敏试验:对分离的61株孢子丝菌分别转种马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和BHI培养基获得菌丝相和酵母相菌落,比较两种生物学形态的孢子丝菌的体外药物敏感性差别。采用SensititreTM YeastOneTM药敏板、微量液基稀释法检测菌丝相和酵母相孢子丝菌对临床常用抗真菌药物伊曲康唑、两性霉素B、伏立康唑、泊沙康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净和特比萘芬的体外敏感性,统计菌丝相及酵母相最低抑菌浓度(MIC)值,计算几何均数(GM)、MIC50、MIC90,应用SPSS 19.0软件对MIC值进行非参数秩和检验,P0.05认为差异有统计学意义。结果61株孢子丝菌均可进行双相转化,均可同化葡萄糖和蔗糖,不能同化棉子糖。经测序比对及构建进化树分析,61株菌株均为球形孢子丝菌。经体外药敏试验显示本院临床分离的孢子丝菌菌株菌丝相及酵母相均对特比萘芬最敏感,其次是伊曲康唑,对氟康唑敏感性最差。同一菌株的酵母相与菌丝相相比,对伊曲康唑、特比萘芬、泊沙康唑、伏立康唑、阿尼芬净、米卡芬净、卡泊芬净、5-氟胞嘧啶敏感性更强(P0.05),而氟康唑、两性霉素B对菌丝相及酵母相的差异不明显。结论本院临床分离的孢子丝菌菌株均为球形孢子丝菌,菌丝相及酵母相均对特比萘芬最敏感,其次是伊曲康唑,对氟康唑敏感性最差。同一菌株的酵母相与菌丝相相比,酵母相敏感性更强。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R756
【图文】：
逑７．１致病菌致病能力研宄逡逑研宄显示不同菌种在地理分布（图２）、毒力、致病能力、临床表现、药物敏逡逑感性等方面均存在差异。在孢子丝菌复合体中的６种菌种中，申克孢子丝菌、巴西逡逑孢子丝菌的毒力最强，球形孢子丝菌的毒力居中，墨西哥孢子丝菌、卢里孢子丝菌逡逑的毒力次之，白孢子丝菌的毒力最弱４５。不同地理来源的相同菌种存在差异，如同逡逑为申克孢子丝菌菌种的不同菌株其毒力也不同，可以分为高、中、低不同级别４６。逡逑临床表现中毒力强的菌种更易侵犯淋巴系统或呈皮肤播散性分布，药敏研究结果显逡逑示申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌对唑类抗真菌药物的敏感性较好，而球形孢子丝菌逡逑对特比萘芬的敏感性更强，对唑类抗真菌药物敏感性差４７－５Ｇ。因此基于以上研究结逡逑果
吞噬和杀灭过程，其发挥作用的途径主要通过ＣＢＭ复合体ＣＡＲＤ９－Ｂｃｌｌ０－ＭＡＬＴ１，逡逑激活核转录因子ＮＦ－ｋＢ介导机体免疫反应，使效应细胞分泌丨Ｌ－６、ＴＮＦ－ｃｕ邋ＩＬ－１２等逡逑炎症因子，进一步促进炎症反应５７－５９。（图３）逡逑＂＂＾S缅逦畔撸拖赴义希希澹悖簦椋睿戾危模澹悖簦椋睿插义希希粒遥模瑰澹拢悖停蹋希义希停粒蹋裕兀义希义希危棋澹耄洛危掊味 义希海蹋海兀插义贤迹尘奘上赴ü茫蹋沂芴迨侗鹫婢乖安庖叻从Φ男藕磐罚ㄗ曰嫱迹╁义希保跺义
本文编号：2803530
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R756
【图文】：
逑７．１致病菌致病能力研宄逡逑研宄显示不同菌种在地理分布（图２）、毒力、致病能力、临床表现、药物敏逡逑感性等方面均存在差异。在孢子丝菌复合体中的６种菌种中，申克孢子丝菌、巴西逡逑孢子丝菌的毒力最强，球形孢子丝菌的毒力居中，墨西哥孢子丝菌、卢里孢子丝菌逡逑的毒力次之，白孢子丝菌的毒力最弱４５。不同地理来源的相同菌种存在差异，如同逡逑为申克孢子丝菌菌种的不同菌株其毒力也不同，可以分为高、中、低不同级别４６。逡逑临床表现中毒力强的菌种更易侵犯淋巴系统或呈皮肤播散性分布，药敏研究结果显逡逑示申克孢子丝菌、巴西孢子丝菌对唑类抗真菌药物的敏感性较好，而球形孢子丝菌逡逑对特比萘芬的敏感性更强，对唑类抗真菌药物敏感性差４７－５Ｇ。因此基于以上研究结逡逑果
吞噬和杀灭过程，其发挥作用的途径主要通过ＣＢＭ复合体ＣＡＲＤ９－Ｂｃｌｌ０－ＭＡＬＴ１，逡逑激活核转录因子ＮＦ－ｋＢ介导机体免疫反应，使效应细胞分泌丨Ｌ－６、ＴＮＦ－ｃｕ邋ＩＬ－１２等逡逑炎症因子，进一步促进炎症反应５７－５９。（图３）逡逑＂＂＾S缅逦畔撸拖赴义希希澹悖簦椋睿戾危模澹悖簦椋睿插义希希粒遥模瑰澹拢悖停蹋希义希停粒蹋裕兀义希义希危棋澹耄洛危掊味 义希海蹋海兀插义贤迹尘奘上赴ü茫蹋沂芴迨侗鹫婢乖安庖叻从Φ男藕磐罚ㄗ曰嫱迹╁义希保跺义
本文编号：2803530
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