云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌PCR检测及其流行病学意义

发布时间：2020-08-25 17:41

【摘要】：目的了解云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的分布及其流行现状;完善三种致病耶尔森菌的PCR基因检测方法。方法1.样本采集:共选取云南省野鼠鼠疫疫源地和云南省家鼠鼠疫疫源地共11个地区,家鼠鼠疫疫源地包括:梁河县、宜良县、保山市、弥勒县、弥渡县、玉溪市、文山市;野鼠鼠疫疫源地包括:玉龙县、剑川县、洱源县、鹤庆县。捕鼠采用鼠铗法;同时采集部分家鼠鼠疫疫源地的犬类肛拭子。2.三种致病耶尔森氏菌筛查基因确定:通过对采集的部分样本进行实验,确定筛查三种致病耶尔森氏菌的目标基因。3.PCR初筛:将采取的鼠结盲肠部及其内容物和犬类肛拭子共4985份样本置于10mL改良磷酸盐缓冲液(PBS)中,4℃冷增菌15-21天后用其沉淀液提取DNA,并对foxA、inv、0392基因进行PCR筛查。4.细菌筛查:将初筛过程中PCR阳性样本接种在CIN琼脂平板上,于28℃条件下、24h培养,挑取可疑菌落对foxA、inv、0392基因进行细菌PCR筛查。5.保菌处理:对细菌筛查阳性样本,提取其DNA进行PCR检测并保存其纯菌样本,置于-80℃冰箱保存。6.对实验结果进行统计和分析:数据分析采用R×C列联表的χ~2检验,使用SPSS17.0进行统计分析,检验水准P0.05为有统计学差异。结果1.三种致病耶尔森氏菌筛查基因确定情况:2016年1-5月采集宜良、丽江、弥勒、弥渡四个地区1344份样本和其他菌株进行foxA、inv、F1、0392基因筛查。其中foxA、inv基因分别对筛查小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌筛查具有特异性,F1基因对筛查鼠疫耶尔森氏菌会出现非特异性条带,0392基因对鼠疫耶尔森菌筛查不会出现非特异性条带具有特异性,采用0392基因作为对鼠疫耶尔森菌筛查的目标基因。2.云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的分离情况:2016年1月至2017年10月,共采集云南省11个地区样本4985份样本,其中foxA阳性样本菌株共248株,分离为4.97%;初筛0392阳性样本6份,阳性率0.12%、初筛inv阳性样本0份。3.云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森菌的统计学分析:云南省11个地区的三种致病耶尔森氏菌阳性率不完全相同(χ~2=197.944,P0.05);其中0392基因统计分析P0.05,无统计学意义。foxA阳性菌株(χ~2=333.74,P0.05)具有统计学差异。Inv均为阴性无差异。4.云南省部分鼠疫疫源地鼠类和犬类统计学分析:鼠类样本共4284份,犬类样本共701份。其中鼠类foxA阳性菌株有225株,分离率为4.97%。犬类肛拭子foxA阳性菌株有23株,分离率为3.28%,统计分析(χ~2=4.95,P=0.0240.05)具有统计学差异,即鼠类foxA阳性菌株分离率高于犬类肛拭子foxA阳性菌株分离率。5.云南省野鼠鼠疫疫源地和家鼠鼠疫疫源地统计学分析:云南省野鼠疫源地和家鼠疫源地foxA阳性菌株分离率不完全相同(χ~2=164.51,P0.05),野鼠鼠疫疫源地的foxA阳性菌株分离率比家鼠鼠疫疫源地的分离率高。其中在野鼠鼠疫疫源地中玉龙县的foxA阳性菌株分离率比其他三个县的分离率高,在家鼠鼠疫疫源地以梁河县和弥勒县的foxA阳性菌株分离率较高。6.云南省部分鼠疫疫源地foxA阳性菌株在鼠类型分布情况:不同鼠类型的foxA阳性菌株分离率有差异(χ~2=86.20,P0.05)。其中家鼠鼠疫疫源地鼠类型主要是褐家鼠和黄胸鼠,野鼠鼠疫疫源地鼠类型主要是齐氏姬鼠、大绒鼠和中华姬鼠。对五种鼠类型进行两两比较:大绒鼠和齐氏姬鼠的foxA阳性菌株分离率要高于其他三种鼠的分离率,且foxA阳性菌株分离率主要分布在野鼠鼠疫疫源地,以齐氏姬鼠、大绒鼠为主。7.玉龙县和剑川县foxA阳性菌株分布情况:玉龙县鼠类样本共有853份,以南溪村委会旦后村foxA阳性菌株分离率最高。玉龙县的鼠类样本以大绒鼠foxA阳性菌株分离率要高于其他类型鼠类。剑川县样本包括鼠样本794份样本,foxA阳性菌株分离率较高地区主要集中在石龙村和长乐村。剑川县采集鼠类样本foxA阳性菌株分离率无统计学差异。结论1.云南省野鼠鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森菌鼠类标本总体分离率高于家鼠鼠疫疫源地。2.在初筛疫源地现场标本或者处理鼠疫疫情时,使用鼠疫菌染色体上的特异基因如YPO0392上基因比在质粒上的F1基因进行PCR中更具说服力。3.在对疫源地的三种致病耶尔森菌监测中,可采用0392、foxA、inv三种目标基因进行组合筛查三种致病耶尔森菌。
【学位授予单位】：大理大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R516.8;R181.3
【图文】：

分布图,云南省,鼠疫疫源地,耶尔森氏菌

1982-2017年云南省鼠疫流行分布图

鼠疫疫源地,样本数量,耶尔森菌,云南省

材料与方法1 实验材料1.1 云南省部分鼠疫疫源地中致病耶尔森氏菌 PCR 检测的实验材料云南省 11 个地区样本采集情况对云南省部分鼠疫疫源地 11个地区共采集样本4985份样本，其中梁河县样量 443 份；玉溪样本数量 416 份；玉龙县鼠样本数量 853 份；宜良县样本数5 份；剑川县鼠样本数量 794 份；洱源县鼠样本数量 86 份；鹤庆县鼠样本 267 份；保山市样本数量 405 份；文山市样本数量 402 份；弥勒样本数量；弥渡样本数量 399 份。见图 2。

鼠类,样本采集,情况,绒鼠

图 3 11 个地区鼠类和犬类样本采集情况（Figure 3:Sample collection of rodents and dogs in 11 areas）在云南省 11 个地区采集的 4284 份鼠类样本中，其中鼠类型有 15 种，其中包括齐氏姬鼠 1137 份，黄胸鼠 1032 份、绒鼠 761 份、褐家鼠 307 中华姬1 等。具体见图 4。

【参考文献】