恶性疟原虫富组氨酸蛋白2（PfHRP2）单克隆抗体制备、表位识别及其POCT应用研究

发布时间：2020-08-29 10:45

　　疟疾是一种由按蚊传播的寄生虫病,严重危害人类健康。WHO最新资料显示,到2014年全球仍有66万人死于疟疾及其引发的相关疾病,其中90%的疟疾致死病例发生在非洲,他们当中大多数是5岁以下的儿童。疟疾的流行给疫区人们的健康和生活造成了毁灭性影响,严重阻碍了社会的发展。恶性疟是最为凶险的一种疟疾,富组氨酸蛋白2(Plasmodium falciparum Histidine-rich protein 2,HRP2)是恶性疟原虫分泌的一种特有的水溶性生物标志物。WHO建议所有疟疾疑似患者应该即时进行疟疾的检测,疾病的快速、准确诊断对于抗疟药的正确使用,避免耐药株的产生及控制病情恶化、降低死亡率至关重要。目前在Pf HRP2蛋白的空间结构以及单克隆抗体与Pf HRP2蛋白结合的表位识别区域等方面存在很多研究领域的空白;而且现在使用的检测该蛋白的试剂灵敏度一般在每微升100个原虫的检测范围,在低密度原虫感染的情况下有漏检的风险。为了探究恶性疟原虫诊断标志物Pf HRP2蛋白的结构特性,筛选性能优异的单克隆抗体,并了解蛋白与抗体之间结合的特性,以及实现更高灵敏度和特异性的检测方法和性能提升,我们系统性地进行了实验设计并实施实验,具体研究内容和结果如下:(1)Pf HRP2天然蛋白的提纯和重组蛋白的表达。从体外培养的上清及虫体中提纯天然蛋白并通过原核表达系统重组表达Pf HRP2蛋白。为了得到浓度更高的抗原,本研究从红内期收集培养虫体及上清,用超声波破碎受感染的红细胞,充分释放抗原,继而利用亲和免疫层析方法提纯Pf HRP2天然抗原;本实验同时构建了Pf HRP2原核表达载体,采用含T7噬菌体启动子的原核高效表达载体p ET-30a(+)进行蛋白表达。实验结果表明构建的表达载体p ET-30a(+)/HRP2,可表达Pf HRP2可溶蛋白。表达的重组蛋白及天然蛋白经快速诊断试剂和免疫印迹实验验证,均表明原核表达Pf HRP2蛋白和天然Pf HRP2蛋白与抗体具有良好的共识性。制备的天然抗原及重组蛋白为后面章节的HRP2抗原免疫,筛选高特异性抗HRP2单克隆抗体,表位鉴定及研制Pf HRP2为标志物的高灵敏度恶性疟POCT提供基础。(2)Pf HRP2特异性单克隆抗体的制备及鉴定。本研究在实验室已有的单抗制备基础上,优化免疫方案及筛选模式,选用基因重组表达的HRP2蛋白和片段化重组HRP2蛋白作为复合免疫原免疫小鼠。片段表达的HRP2蛋白选取亲水性和易曲性指数较高的片段,在筛选环节选用重组抗原对融合细胞进行初筛,过滤掉不分泌抗体或分泌抗体低的细胞株,保留阳性值高的细胞株继续扩大培养;继而用天然蛋白进行检测,筛选出能够与天然结构结合的细胞株,保留分泌抗体效价高,特异性高的阳性细胞株继续培养定株。经小鼠体内诱生法制备腹水,纯化得到四株稳定分泌抗Pf HRP2的单克隆抗体杂交瘤细胞株3A5、1F6、1C10、5C7。针对抗体进行效价、亚类、特异性、稳定性、染色体的鉴定。研究表明,四株细胞分泌的单克隆抗体的亚类1株为Ig M亚类,其余3株均为Ig G1;抗体亲和力均大于10-7,表明制备的单克隆抗体与Pf HRP2蛋白的高结合能力;免疫印迹法及RDT的结果显示四株抗体与Pf HRP2蛋白特异性结合。(3)肽序列扫描及噬菌体肽库筛选Pf HRP2单克隆抗体抗原结合表位。HRP2是一类基因多态性的蛋白质,为了探究该蛋白的表位及研究四株单克隆抗体(3A5,1F6,1C10,5C7)识别位点,本研究用肽序列扫描法及噬菌体随机十二肽库筛选方法进行模拟表位分析鉴定。肽序列扫描实验中,根据Pf HRP2蛋白序列及预测表位特性设计合成18条多肽,以15个氨基酸为一段多肽,5个氨基酸覆盖,进行表位鉴定;噬菌体肽库的筛选选用亲和筛选法。实验结果表明,研制的单克隆抗体的识别位点包括线性表位和构象表位两类。识别的氨基酸序列有HHAH、AT(S/L)DHH、AAN(S)HH、ADHHH。其中1F6识别的是构象表位,虽然该抗体在多肽序列扫描中无法识别多肽段,但是通过噬菌体的十二肽库能准确识别其中的位点。位点的确定对于POCT试剂在单克隆抗体的选择上有了进一步的精确靶标,以确定最佳的结合Pf HRP2氨基酸位点的单克隆抗体的选择和应用。(4)HRP2免疫荧光快速诊断方法的建立及其应用评估。研究采用荧光纳米颗粒标记不同位点Pf HRP2单克隆抗体,通过双抗体夹心法实现抗原捕获,采用小型仪器将试剂条上地荧光信号转化成电信号实现检测,建立了一种全新的快速检测Pf HRP2抗原POCT荧光检测免疫层析的方法及试剂。实验结果表明该方法最低检出原虫密度可以达到25个原虫/μL,较常规的免疫层析快速诊断试剂的灵敏度有较为明显的提升。对研制试剂的精密度,稳定性,干扰实验及交叉实验性能评估结果表明指标都符合要求。在临床实验评估中,多中心的平行比对研究表明研制试剂与参比试剂的阳性符合率为100%,阴性符合率为99.6%,总符合率为99.7%。本课题基于Pf HRP2蛋白为研究对象,从蛋白提取表达、单克隆抗体的制备、抗原抗体结合表位分析到免疫荧光检测系统的建立,进行系统深入的研究和分析。本研究的创新性体现在以下三点:第一,采用新的免疫策略和筛选方法,制备四株具有高亲和力、高特异性的Ig M和Ig G不同亚类的抗Pf HRP2蛋白单克隆抗体;第二,使用肽序列扫描法及噬菌体展示技术发现了Pf HRP2抗原新的模拟表位,Pf HRP2与单克隆抗体与抗体的识别不但存在线性表位也存在构象表位的结合;第三,建立了一种新的高灵敏度Pf HRP2荧光检测方法及相应试剂,将灵敏度提升到25个原虫/微升血,超越了现有快速诊断试剂100个原虫/微升血的检测水平,为Pf HRP2的标志物检测灵敏度偏低的现状提供有效的解决方法。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R531.3

【参考文献】