宽谱中波紫外线对马拉色菌致花斑糠疹色素变化的影响初探及不同来源的64株马拉色菌ITS、特异区基因型特点分析

发布时间：2020-08-28 19:52

　　第一部分马拉色菌和人原代角质形成细胞共培养液在宽谱中波紫外线影响下对人原代黑素细胞黑素合成的影响目的:建立球形马拉色菌与人原代角质形成细胞即HEKs细胞的共培养模型,并观察共培养体系在或不在中波紫外线UVB暴露下对人原代黑素细胞即HEMs细胞的增殖、酪氨酸酶活性、酪氨酸蛋白酶在蛋白水平的合成及重要黑素合成通路蛋白的影响。方法:用CCK8方法检测不同浓度球形马拉色菌(CBS7966)对HEKs增殖率的影响,并利用实时细胞分析(RTCA)系统监测不同浓度马拉色菌对HEKs增殖曲线的影响,找到马拉色菌与HEKs细胞共培养最佳比例,建立共培养模型。试验组分为六组,即HEKs单独培养组;HEKs与马拉色菌共培养组;HEKs单独培养并接受15mJ/cm2UVB照射组;HEKs与马拉色菌共培养并接受15mJ/cm2UVB照射组;HEKs单独培养并接受75mJ/cm2UVB照射组;HEKs与马拉色菌共培养并接受75mJ/cm2UVB照射组。收集上述六组上清,转而培养原代黑素细胞即HEMs细胞,利用实时细胞分析(RTCA)系统监测各组培养上清对HEMs细胞的增殖曲线影响,用多巴氧化法检测各组培养上清对HEMs酪氨酸酶活性的影响;采用transwell小室共培养方法将上述各组细胞与HEMs细胞共培养,Western-blot方法检测HEMs酪氨酸蛋白酶TYR、酪氨酸相关蛋白酶1(TRP1),及重要相关通路蛋白MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的合成。结果:球形马拉色菌与HEKs以比例1:1共培养时,马拉色菌不会干扰HEKs细胞增殖活性,但2.5:1及以上组均在一定时间后对HEKs细胞增殖活性产生显著抑制作用(p0.05)。非紫外线暴露时,各组对HEMs细胞的增殖,酪氨酸酶活性,TYR、TRP1、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的蛋白合成均无显著影响(p0.05)。低剂量(15 mJ/cm2)UVB照射后:球形马拉色菌抑制了 HEKs培养上清对HEMs细胞的促增殖作用(p0.05);HEKs促进了 HEMs细胞TRP1蛋白合成(p0.05),球形马拉色菌对其促进作用显著无影响;球形马拉色菌与HEKs共培养组及HEKs单独培养组对TYR活性无显著影响,对TYR、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的蛋白合成无显著影响(p0.05);高剂量(75mJ/cm2)UVB照射后:HEKs培养上清抑制了 HEMs增殖活性,而球形马拉色菌对其抑制作用无显著影响;球形马拉色菌抑制了 HEKs培养上清对HEMs细胞酪氨酸酶活性的促进作用,抑制了 HEKs培养上清对黑素合成通路蛋白TYR、TRP1、MITF、磷酸化ERK及磷酸化CREB1的促合成作用。结论:宽谱中波紫外线暴露下球形马拉色菌通过与HEKs相互作用,抑制了HEKs细胞对HEMs细胞的促增殖作用、对酪氨酸酶活性的促进作用、对TYR、TRP1、MITF、p-ERK及p-CREB1合成的促进作用,可能对UVB暴露引起的色素沉着产生一定抑制作用。第二部分马拉色菌在宽谱中波紫外线影响下对人角质形成细胞合成分泌黑素合成相关细胞因子的影响第一章马拉色菌在宽谱中波紫外线影响下对原代人表皮角质形成细胞(HEKs)合成分泌黑素合成相关细胞因子的影响目的:观察球形马拉色菌对HEKs细胞分泌的一些黑素合成相关细胞因子的影响。并观察不同强度UVB照射下马拉色菌对这些因子产生的影响。方法:试验组分为六组,即HEKs单独培养组;HEKs与马拉色菌共培养组;HEKs单独培养并接受15mJ/cm2UVB照射组;HEKs与马拉色菌共培养并接受15mJ/cm2UVB照射组;HEKs单独培养并接受75mJ/cm2UVB照射组;HEKs与马拉色菌共培养并接受75mJ/cm2UVB照射组。通过ELISA方法检测上述六组球形马拉色菌与HEKs共培养体系及HEKs单独培养组上清IL-1 α、IL-6、TNF-α、SCF、GM-CSF、b-FGF、EDN1、α-MSH、NT-3、PGE2蛋白表达,用RT-PCR方法检测细胞裂解液中上述细胞因子的mRNA表达。结果:在非紫外线暴露时,球形马拉色菌可刺激HEKs细胞EDN1、PGE2、IL-1α蛋白及mRNA的表达(p0.05),对其他细胞因子无影响(p0.05)。紫外线 UVB 暴露下,HEKs 分泌的 IL-1α、IL-6、TNF-α、SCF、GM-CSF、b-FGF、EDN1、PGE2蛋白表达增加,COX-2、NT-3、POMCmRNA表达增加(NT-3,a-MSH只检测到了 mRNA)(p0.05)。低剂量(15mJ/cm2)UVB照射条件下,球形马拉色菌可进一步刺激除TNF-α之外上述细胞因子的表达,对TNF-α表达无影响。而在高剂量(75mJ/cm2)UVB照射条件下,除了进一步刺激IL-1α、IL-6、GM-CSF蛋白及mRNA的表达之外,球形马拉色菌抑制了 EDN1蛋白及mRNA、TNF-α蛋白及mRNA,COX-2、POMC、NT-3mRNA 的表达(p0.05),对 SCF 及 bFGF 蛋白及mRNA表达无影响(p0.05)。结论:非UVB暴露或低剂量UVB暴露下,球形马拉色菌可刺激HEKs分泌促黑素合成细胞因子。在高剂量UVB暴露下,马拉色菌可抑制HEKs分泌促黑素合成细胞因子,促进HEKs分泌抑制黑素合成的部分细胞因子。第二章马拉色菌在宽谱中波紫外线影响下对人永生化角质形成细胞(hacat细胞)分泌黑素合成相关细胞因子的影响目的:建立球形马拉色菌与hacat细胞的共培养模型,观察球形马拉色菌对hacat细胞分泌的一些黑素合成相关细胞因子的影响。并观察不同强度UVB照射下马拉色菌对这些因子产生的影响。方法:用CCK8方法检测不同浓度球形马拉色菌对hacat细胞增殖率的影响,并利用实时细胞分析(RTCA)系统监测不同浓度马拉色菌对hacat细胞增殖曲线的影响,找到马拉色菌与HEKs细胞共培养最佳比例,建立共培养模型,并通过ELISA方法检测不同剂量(0mJ/cm2,15mJ/cm2,75mJ/cm2)宽谱U-VB照射下球形马拉色菌与hacat细胞共培养体系及hacat单独培养组上清IL-1α、IL-6、TNF-α、b-FGF、ET-1、SCF、PGE2 蛋白表达。结果:hacat与马拉色菌在1:1比例共培养时,在48h内会促进hacat细胞增殖(p0.05)。而比例1:1时,在72h内对hacat细胞增殖无显著影响(p0.05)。在一定剂量UVB暴露下,hacat单独培养组细胞分泌的IL-1α、IL-6、TNF-α、ET-1、PGE2细胞因子蛋白浓度显著增加(p0.05),而b-FGF和SCF分泌量无明显变化(p0.05)。在15mJ/cm2UVB照射条件下,球形马拉色菌促进了 IL-1α蛋白分泌(p0.05),抑制了 IL-6、ET-1、TNF-α 蛋白分泌(p0.05),对 PGE2、b-FGF 和 SCF则无明显影响(p0.05)。在75mJ/cm2UVB照射条件下,马拉色菌对IL-6和TNF-α蛋白分泌蛋白分泌量有抑制作用(p0.05),而对其他细胞因子则无显著影响(p0.05)。结论:球形马拉色菌通过与hacat细胞相互作用,在不同紫外线照射条件下,对hacat细胞的黑素合成相关细胞因子分泌影响不同。在15mJ/cm2UVB暴露下,可抑制ET-1的蛋白分泌,可能抑制了紫外线暴露引起的色素沉着。但需后续试验进一步证实。第三部分不同来源的64株马拉色菌ITS、特异区基因型特点目的:对64株不同地方来源的马拉色菌(Pityrosporum)进行ITS,b3和b6测序和演化分析。方法:收集来自南京、四川、上海和江西四个地区的64株马拉色菌临床株,提取DNA,并进行ITS,b3和b6区PCR扩增及PCR产物纯化,测序后进行序列分析,用mega构建进化树。结果及结论:通过对Pityrosporum ITS、b3和b6序列的克隆、测序和序列分析,研究发现来自南京地区的Pityrosporum的单倍型和核苷酸多样性都是最高的。Pityrosporum地域性和基因型没有明显的相关性,菌株的基因型和感染的部位也没有明确的相关性,但是相同的Pityrosporum在基因型上差异又是比较大的,如南京地区分离的M.furfur,存在较大的基因多样性。我们发现不同地区的菌株的多样性高低不同,这可能与受到选择压力的影响有关。系统进化显示同种的菌株也存在较大的差异。通过用ITS、特异序列b3和b6的研究发现,特异序列b6比ITS和b3更适合于研究Pityrosporum的基因多态性。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R756
【部分图文】：

形态,表皮黑素细胞,免疫荧光染色,原代培养

３．１邋ＨＥＫｓ细胞形态学逡逑取包皮后三天及一周时倒置显微镜观察细胞形态，细胞贴壁生长，形态为多逡逑角形。（见图１－１）逡逑ＩＨ逡逑图１－１：邋ＨＥＫｓ原代培养镜下形态，左图为第３天形态，右图为１周时形态逡逑（４0ｘ）逡逑３．２原代人表皮黑素细胞细胞形态学及免疫荧光染色鉴定逡逑３．２．１原代人表皮黑素细胞培养镜下形态学观察逡逑黑素细胞培养３天后镜下可见较多呈卵圆形生长不良的角质形成细胞，其周逡逑边仅有少量具２－４个树枝状突起的黑素细胞（图１左）。黑素细胞开始时生长缓慢，逡逑角质形成细胞逐渐减少。２周后，仅见少量角质形成细胞残留，黑素细胞则数量逡逑明显增多，树突及轴丝增长，呈梭形，树突多为２－３个，中央细胞核折光性较强，逡逑成群网状排列（图１右）。逡逑ｍｕ逡逑图１邋：ＨＥＭｓ原代培养镜下形态，左图为第３天形态，右图为２周时形态（４0ｘ）逡逑３．２．２原代人表皮黑素细胞免疫荧光染色鉴定逡逑经过ｍｅｌａｎＡ及Ｓ１００荧光染色后，可见细胞浆和细胞核被染成红色（９０％逡逑以上细胞）

形态图,形态,原代培养,表皮黑素细胞

上排,马拉色菌,比例,增殖率

图２：邋ｍｅｌａｎＡ及Ｓ１００焚光染色结果（上排三个图为ｍｅｌａｎＡ染色结果，下逡逑排三个图为Ｓ１００染色结果）逡逑３．３不同浓度马拉色菌对ＨＥＫｓ细胞增殖率的影响（ＣＣＫ－８法）逡逑如图１－２，共培养２４ｈ后，１：１比例组（ＨＥＫｓ：马拉色菌）细胞增殖率要高于逡逑对照组，但无统计学意义（ｐ＞０．０５）。２４ｈ其余比例组、４８ｈ及７２ｈ各比例组细逡逑胞增殖率均小于对照组。７２ｈ内１：１及１：１０比例组与对照组相比，马拉色菌对逡逑ＨＥＫｓ细胞增殖率无影响。在培养４８ｈ、７２ｈ后，１：２０和１：４０比例组与对照组相逡逑比，ＨＥＫｓ增殖率受到显著抑制（ｐ＜０．０５）。逡逑１５0ｉ逡逑＾邋ＫＣ逡逑５逦ｊ逦■邋１：１逡逑０邋ａｎｎ逦％逦＿逦Ｇ＾３邋１＇邋１０逡逑＾逦Ｉ媝自ｍ曑自＾W自虹ｒ邋ｓ邋１２０逡逑ｒａ１４０逡逑

【参考文献】