我国三种类型黑热病流行区利什曼原虫分离株分子分型及感染力的研究

发布时间：2020-09-16 21:36

　　目的:分析评价来自我国三个内脏利什曼病流行区利什曼原虫分离株遗传和感染力的差异。方法:通过设计特异引物扩增来自我国不同利什曼病流行区利什曼原虫分离株的hsp70和ITS 1序列,构建进化树以阐明其遗传关系;选择来自三个黑热病流行区的3个代表性分离株前鞭毛体分别接种于NNN培养基、M199+20%胎牛血清培养基、M199+20%马血清培养基及脑心浸液培养基,构建生长曲线;应用合适培养基培养利什曼原虫,收集处于稳定生长期的前鞭毛体感染BALB/c小鼠,分别于感染后的1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周处死小鼠取样,用qPCR绝对定量法检测小鼠肝脏、脾脏虫荷,用ELISA法检测小鼠血清中的特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a、IgM及细胞因子IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ、TGF-β的水平。结果:应用特异于利什曼原虫hsp70序列的引物从我国10个利什曼原虫分离株均扩增出 1442bp片段,分离株JIASHI-1、JIASHI-5、XJ771、KXG-Xu、KXG-Liu、927、Cy、SC6序列间的同源性为100%,801和KS-2分离株同源性为100%,分离株序列间仅有1个碱基显示差异。应用特异于利什曼原虫ITS1序列的引物,从来自人-犬共患型内脏利什曼病流行区的SC6和Cy分离株均扩增出318bp片段;从来自新疆克拉玛依皮肤利什曼病流行区的KXG-Xu、KXG-Liu和927分离株均扩增出312bp片段;从来自新疆自然疫源型内脏利什曼病流行区的JIASHI-1、JIASHI-5和XJ771分离株均扩增出313bp片段;从来自新疆喀什人源型内脏利什曼病流行区的801和KS-2分离株均扩增出316bp片段。序列比对分析显示来自相同流行区的利什曼原虫分离株的ITS1序列完全相同。构建的进化树显示10个分离株聚集成2个群和3个亚群:Ⅰ群包括A亚群和B亚群,属婴儿利什曼原虫,Ⅱ群为杜氏利什曼原虫。来自不同内脏利什曼病流行区的代表性利什曼原虫分离株KS-2、Cy和JIASHI-5均能在NNN培养基、M199+20%胎牛血清培养基和M199+20%马血清培养基生长繁殖,KS-2分离株在相应培养基上繁殖最快。分别应用利什曼原虫分离株KS-2、Cy和JIASHI-5前鞭毛体感染BALB/c小鼠。在肝脏,KS-2分离株感染鼠虫荷最多,在感染第4周时达到峰值,随后逐渐减少至较低水平,第12周时最少。JIASHI-5分离株感染鼠虫荷在感染后第1周时达到峰值,随后逐渐减少,在感染10周时最少。Cy分离株感染鼠虫荷最少,在第4周时达到峰值,随后缓慢减少,第8周时最少。在感染的各时段以KS-2分离株感染鼠虫荷最多,JIASHI-5虫株感染鼠次之。在脾脏,以KS-2分离株感染鼠虫荷最多,感染前2周时虫荷较少,在感染6周时达到峰值,随后有所减少。感染JIASHI-5分离株后,前2周只能在脾脏中检测到极少的虫荷,第4周时达到峰值,随后逐渐减少。Cy分离株感染鼠虫荷最少,在第6周时达到峰值,随后逐渐减少。在感染的各时段以KS-2分离株感染鼠虫荷最多,JIASHI-5虫株感染鼠次之。三个利什曼原虫分离株感染鼠血清中细胞因子IFN-γ、TGF-β、IL-10浓度均升高,其中以KS-2感染鼠3种细胞因子增加均最高;IL-2、IL-12浓度均降低。三个利什曼原虫分离株感染鼠血清中均检测到利什曼原虫特异的IgM、IgG、IgG1和IgG2a抗体,且随感染进程相应特异抗体水平均呈上升之势。Cy分离株感染鼠IgM、IgG和IgG2a抗体水平在整个观察期间均低于KS-2和JIASHI-5分离株感染鼠相应特异抗体水平。结论:1.来自三个黑热病流行区的利什曼原虫分离株存在遗传差异。2.来自三个流行区的利什曼原虫分离株在不同培养基中生长繁殖存在差异。3.来自三个流行区的利什曼原虫分离株对BALB/c小鼠的感染力及诱导的小鼠细胞免疫和体液免疫也存在差异。
【学位单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R531.6
【部分图文】：

利什曼原虫,系统进化树,基因序列,内脏利什曼病

图２基于利什曼原虫ｈｓｐ７０基因序列以邻接法构建的系统进化树逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ邋ｈｓｐ７０邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ逡逑２．１．２基于ＩＴＳ邋１序列分析逡逑应用所设计特异扩增利什曼原虫ＩＴＳ１序列的引物从１０株分离于我国不同利逡逑什曼病流行区的利什曼原虫分离株均扩增出一单一片段（图３），测序显示，从逡逑不同分离株扩增的ＩＴＳ１序列长度为３１２ｂｐ－３１８ｂｐ（表２）。其中，来自新疆克拉玛逡逑依皮肤利什曼病流行区的３个分离株ＫＸＧ－Ｘｕ、ＫＸＧ－Ｌｉｕ、９２７均扩增出３１２ｂｐ逡逑．片段；来自新疆自然疫源型内脏利什曼病流行区的３个分离株ＪＩＡＳＨＩ－１、逡逑ＪＩＡＳＨＩ－５和ＸＪ７７１均扩增出３１３ｂｐ片段；来自新疆喀什人源型内脏利什曼病流逡逑行区的２个分离株８０１和ＫＳ－２均扩增出３１６ｂｐ片段；来自人－犬共患型内脏利什逡逑１６逡逑

序列,利什曼原虫,系统进化树,序列

序列（表３）构建进化树以分析这些分离株的亲缘关系，结果显示我国１０株利逦．逡逑什曼原虫分离株聚集成两个群（Ｉ和ＩＩ邋）和３个亚群（Ａ、Ｂ、Ｃ）（图５），邋ＪＩＡＳＨＩ－１、逡逑ＪＩＡＳＨＩ－５和ＸＪ７７１分离株聚集为Ａ群，ＫＸＧ－Ｘｕ、ＫＸＧ－Ｌｉｕ、９２７分离株聚集为逡逑Ｂ邋群，他们与婴儿利什曼原虫邋ＭＨＯＭ／ＵＺ／２００７／ＯＢＡ、ＭＨＯＭ／ＩＲ／０４／ＩＰＩ－ＵＮ１０、逡逑ＭＨＯＭ／ＵＺ／２００７／ＭＵＡ邋及邋ＭＨＯＭ／ＢＲ／７４／ＰＰ７５邋分离株聚集在群邋Ｉ邋；邋Ｃｙ、ＳＣ６、８０１逡逑和ＫＳ２分离株与杜氏利什曼原虫分离株ＭＨＯＭ／ＩＮ／８０／ＤＤ８、逡逑ＭＨＯＭ／ＥＴ／０８／ＤＭ３０９－Ｃ１３、ＭＨＯＭ／ＥＴ／０８／ＤＭ３０９－Ｃ１１邋和邋ＭＨＯＭ／ＫＥ／７５／Ｈ９邋聚集逡逑为Ｃ群

熔解曲线,标准品,序列,利什曼原虫

纯化后的浓度为９６ｎｇ／ｐｌ。应用此扩增产物ｋ行焚光定量ＰＣＲ扩增，绘制绝逡逑对定量法标准曲线，得到标准曲线公式为ｙ＝－３．３７４１0ｇｘ＋４０．２５７邋（图９），且熔解逡逑曲线呈单一峰（图１０），ＰＣＲ产物单一，表明标准品ＤＮＡ纯度高。逡逑举．１…逡逑．１．逡逑－Ｉ，—逡逑Ｍ：ＤＮＡ标志物１？３：依次为我国流行区分离的利什曼原虫分离株ＫＳ－２、Ｃｙ、ＪＩＡＳＨＩ－５；Ｎ：逡逑阴性对照逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ邋ｍａｒｋｅｒ；邋１邋？３邋Ｔｈｅ逦ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｆｒｏｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｎｄｅｍｉｃ邋ａｒｅａｓ邋ｉｎ邋Ｃｈｉｎａ，邋ＫＳ－２、Ｃｙ、逡逑ＪＩＡＳＨＩ－５；邋Ｎ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑图８我国利什曼原虫分离株ＳＳＵｒＲＮＡ序列ＰＣＲ扩增产物电泳图逡逑Ｆｉｇ．邋８邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋ＳＳＵｒＲＮＡ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ邋ｆｒｏｍ

【相似文献】