目的:(1)研发制备抗多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫等同表面蛋白Em10单克隆抗体;(2)确定单克隆抗体对不同虫体发育阶段的识别,以及通过体外培养确定Em10在细粒棘球绦虫原头蚴成虫和成囊双向分化中的表达;(3)对不同分型包虫病人组织标本进行识别和鉴定,并且探索单克隆抗体荧光标记后对包虫感染活体模型的示踪及抗体在体内的代谢,为临床分子诊断包虫病和靶向药物治疗奠定基础。方法:(1)免疫接种:免疫接种BALB/c小鼠,用ELISA方法检测小鼠抗Em10抗体滴度;(2)细胞融合:采集高滴度小鼠的脾脏,制备脾细胞悬液,将脾细胞与小鼠SP2/0细胞融合,用HAT选择培养基筛选获得杂交瘤细胞,并通过ELISA检测抗体滴度,选择阳性孔;(3)阳性孔细胞克隆:阳性孔的细胞通过有限稀释法制备单克隆细胞,筛选分泌抗Em10的克隆细胞,扩增克隆的细胞后储存于液氮中;(4)BALB/c腹水单克隆抗体的产生:雌性BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油,7天后小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,注射后10-13天抽取腹水;(5)单克隆抗体的鉴定:用ELISA,Western Blotting和免疫荧光鉴定单克隆抗体;(6)肝包虫病组织样本的收集与抗体识别:收集泡型包虫病人石蜡样本P1,P2,P3,P4四型30例,囊性包虫病人石蜡样本CE1,CE2,CE3,CE4,CE5五型30例,非包虫病人(肝癌,肝囊肿,肝硬化病人)30例,所有包虫病标本通过PCR和DNA测序确定包虫病样本,用单克隆抗体通过免疫组化确定单克隆抗体对包虫病阳性和阴性组织标本的识别鉴定;(7)原头蚴成虫和成囊双向发育中Em10的表达:收集体外培养的原头蚴,提取不同培养时段的原头蚴蛋白,用Western Blotting分析原头蚴双向发育中Em10的表达。(8)Em10单克隆抗体对包囊的识别:体外培养原头蚴培养液每周换2次,培养2个月后,用PBS漂洗微囊,通过腹腔感染小鼠,获得感染模型,通过小鼠尾静脉注射200μL/只Cy3荧光素标记单克隆抗体,用小动物活体成像仪动态观察抗体与病灶结合部位。另外,注射终浓度0.5mg/mL Cy3荧光素标记单克隆抗体进入体外培养12个月的包囊,每个包囊注射10-30μL,通过小动物活体成像仪观察抗原抗体反应和荧光标记抗体在包囊内的消减。结果:(1)获得了能分泌单克隆抗体的2个细胞株,命名为Mab-Em10-8和Mab-Em10-16;其抗体亚型分别为IgG1和IgG2a。用ELISA检测其细胞培养上清效价达9万以上,用克隆的单克隆细胞制备小鼠腹水,抗体滴度达100万以上;用Western Blotting法进行初步鉴定,抗Em10蛋白的两个单克隆抗体均对重组Em10抗原和虫体自然蛋白有强的特异性识别。(2)其中Mab-Em10-8单克隆抗体可以与成虫(AW)、原头蚴(PSC)自然抗原反应;(3)Mab-Em10-16单克隆抗体可以较强地识别AW、PSC和包囊生发层细胞(GL)提取抗原,与囊型包虫的囊液(HCF)抗原不起反应。(4)MabEm10-8与AE包虫病人组织反应的敏感度为56.67%,特异度为100%。Mab-Em10-8能较强地识别P3型AE肝病灶组织,而Mab-Em10-8较强识别CE1-CE3病灶组织,不识别CE4和CE5病灶组织。Mab-Em10-16可以识别AE病灶组织P2-P4型,且P3型灵敏度最高。Mab-Em10-16识别CE病灶组织与Mab-Em10-8相同;(5)Eg和Em原头蚴的体外培养发现,Em原头蚴较Eg原头蚴难获取包囊,且Em与Eg成囊培养时发现其成囊的形成时间及囊壁厚度的不同,Eg的囊壁比Em厚;(6)通过荧光素标记的单克隆抗体在小鼠体内无明显结合反应。结论:本次实验表明Mab-Em10单克隆抗体对泡型和囊型包虫提取蛋白和组织标本有较好的识别能力,并且与包虫病人的临床分型有关,其中Mab-Em10-16可以识别晚期的P3和P4期泡型包虫病病灶组织,Mab-Em10-8识别P2,P3,P4期泡型包虫病和CE1-CE3囊型包虫病病灶组织。抗Em10单克隆抗体的成功研制对包虫病的诊断和分型有重要的意义,并且研究虫体的发育有积极的作用。
【学位单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R532.32
【部分图文】：
图 1-1 Em10 蛋白浓度检测和 SDS-PAGE 结果Fig 1-1 Em10 protein concentration detection and purity of recomEm10 on SDS-PAGE表 1-1 第 5 次免疫小鼠检测不同稀释梯度小鼠血清效价（ ±s）Table 1-1 Serum titers of mice immunized with Em10 after 5 inje
图 1-3 3#小鼠第 3、4、5 次免疫后检测血清 OD405nm值gure 1-3 Detection of serum OD405nm values after 3, 4, andimmunizationsb-Em10 单克隆细胞第一次筛选种 Em10 产生高效价血清小鼠的脾脏，将脾细胞与小鼠 SP
注：Em10-16、19、8、12、4、2、PC 与对照组 NC 相比*P＜0.05图 1-4 阳性克隆所得细胞株的上清效价Fig 1-4 Anbody titers of positive cell clones (supernatant)
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