IL-33基因敲除小鼠急性弓形虫感染诱发的T细胞免疫应答

发布时间：2020-10-09 18:52

　　目的:本研究通过腹腔注射弓形虫(RH)速殖子及巨噬细胞、淋巴细胞体外共培养感染弓形虫速殖子构建急性弓形虫感染模型,分析IL-33~(-/-)小鼠急性弓形虫感染时巨噬细胞对T细胞的趋化作用,探讨IL-33在小鼠弓形虫感染时的免疫功能。方法:1.基因型鉴定:应用PCR技术鉴定C57BL/6 IL-33~(-/-)小鼠基因型;2.生存率比较:C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠腹腔注射弓形虫RH株10~4个速殖子,1mL/只,对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水,绘制小鼠生存曲线;3.组织病理学变化:C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠腹腔注射弓形虫RH株速殖子10~4个,1mL/只,对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水,分别于感染后48h和96h分离肝、脾及脑组织进行HE染色比较各种组织病理变化;4.体内实验分析IL-33~(-/-)对急性弓形虫感染小鼠脾脏Th1亚群分化和趋化因子受体表达的影响:腹腔注射弓形虫速殖子感染C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠,分别于感染后48h及96h,用流式细胞术检测感染组与未感染组脾脏Th细胞胞内IFN-γ及表面CD195(CCR5)表达情况;5.体外实验探讨IL-33~(-/-)对弓形虫感染时巨噬细胞对T细胞趋化作用的影响:5.1.T细胞表面趋化因子受体表达分析:分离腹腔巨噬细胞与脾脏T细胞共培养,感染弓形虫,于感染后24h,流式细胞术检测感染组与未感染组脾脏T细胞表面CD69及CD195、CD183(CXCR3)、CD186(CXCR6)表达情况;5.2.共培养上清液中趋化因子浓度分析:脾脏T细胞与腹腔巨噬细胞体外共培养同时感染弓形虫24h,ELISA检测C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠感染前后共培养上清中CCL5、CXCL16、CXCL9浓度;5.3.T细胞趋化实验:提取C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞与脾脏T细胞共培养于Transwell小室,于感染后12h、16h、20h及24h,分别计数感染10~2剂量组、10~4剂量组及未感染组进入下室的T细胞数目;6.统计分析方法:使用SPSS 23.0进行统计分析,采用Kaplan-Meier法(K-M法)比较野生型和IL-33~(-/-)型小鼠感染与未感染弓形虫时生存率的差异,描绘小鼠生存曲线,对于服从正态分布的资料,采用One-way ANOVA(单因素分析),分析比较流式细胞术的检测结果,P0.05差异具有统计学意义。结果:1.鉴定出实验所用小鼠为C57BL/6野生型和IL-33基因敲除型;2.腹腔感染弓形虫,IL-33~(-/-)小鼠生存时间长于野生型小鼠(P0.05);3.感染小鼠肝组织呈慢性肝炎表现,野生型小鼠病理改变比IL-33~(-/-)小鼠更严重;感染小鼠脾脏,脾窦破裂,脾索走行紊乱,野生型病理改变比IL-33~(-/-)小鼠更严重;感染脑组织,表现为神经元急性坏死,IL-33~(-/-)小鼠出现神经血管袖套样改变,较野生型病理改变更严重;4.弓形虫经腹腔感染野生型及IL-33~(-/-)小鼠,IL-33~(-/-)小鼠未感染组脾脏Th1细胞的比例高于野生型未感染组(84.33±3.11%比52.66±7.60%,P0.01);IL-33~(-/-)小鼠未感染组Th1表面CD195分子表达量高于感染组(194.50±9.52%比99.00±3.87%,P0.01);IL-33~(-/-)小鼠感染组与野生型感染组Th1细胞比例及CD195分子表达均无显著性差异;5.弓形虫感染巨噬细胞和T细胞体外共培养24小时,IL-33~(-/-)小鼠未感染组T细胞表面CD69、Th1细胞表面CD195、CD183分子均高于野生型未感染组(分别为:409.85±11.38%比312.43±26.33%,P0.05;180.14±26.53%比121.00±16.68%,P0.05;166.14±14.42%比114.00±12.60%,P0.05);野生型未感染组Th1细胞表面CD186分子表达量高于野生型感染组(207.00±19.35%比101.28±19.01%,P0.05);6.巨噬细胞和T细胞体外共培养上清中,CCL5在IL-33~(-/-)小鼠感染弓形虫后显著升高(1377.21±126.29%比1062.09±192.59%,P0.05);CXCL9在野生型感染后较IL-33~(-/-)小鼠感染后升高显著(280.66±84.62%比183.86±63.56%,P0.05);CXCL16野生型感染组升高较IL-33~(-/-)小鼠感染组更显著(8210.41±962.21%比3493.38±359.42%,P0.01);7.体外巨噬细胞对T细胞趋化实验,未感染组及感染10~2剂量组各时间点比较差异不具有统计学意义,感染10~4剂量组,IL-33~(-/-)小鼠感染24小时趋化T细胞的数目明显高于12小时(7.17±5.39%比2.43±1.53%,P0.05)。结论:1.急性弓形虫感染,IL-33~(-/-)小鼠较野生型小鼠生存率提高,提示IL-33基因敲除对小鼠弓形虫感染具有保护作用。2.体内及体外弓形虫感染实验,IL-33~(-/-)小鼠弓形虫感染组与野生型感染组比较,巨噬细胞对Th1细胞亚群分化、活化及趋化效应均无明显差异,提示IL-33~(-/-)发挥的保护作用可能不是通过促进Th1亚群细胞免疫功能发挥抗感染作用,具体机制需进一步讨论。
【学位单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R531.8
【部分图文】：

小鼠,野生型,鼠尾,弓形虫

感染与未感染弓形虫时生存率的差异，描绘小的资料，采用 One-way ANOVA（单因素分析）果，P＜0.05 差异具有统计学意义。鉴定e[9]等设计的野生型和 IL-33-/-两对引物序列，采凝胶电泳条带位于 489bp 的为野生型，位于取小鼠鼠尾 DNA 后进行 PCR 的结果。1、2、从吴氏动物中心购买的野生型 C57BL/6 小鼠，PCR 结果理想，符合预期，进行野生型和 IL

小鼠,弓形虫感染,生存分析,野生型

和对照组小鼠的疾病表现，104剂量感染组感染后 3，接着出现闭目、腹部胀大、颤动、呼吸急促，最后。用 Kaplan-Meier 法(K-M 法）进行统计比较野生，P＜0.05 差异有统计学意义，IL-33-/-小鼠急性弓形鼠。

曲线,虫体,野生型,小鼠

野生型与 IL-33-/-小鼠弓形虫感染组与未感染组生存分析曲线 IL生存率高于野生型感染组（P＜0.05）。腔虫体计数腔感染相同剂量的虫体，数天后腹腔内虫体数量的差异反应固有[10]，尤其反应腹腔巨噬细胞的吞噬功能。图 1.3 是感染野生型及腔灌洗液姬母萨染色结果图，光学显微镜下观察 IL-33-/-小鼠腹生型鼠。

【参考文献】