乙型肝炎病毒S蛋白突变与修饰在隐匿性感染发生中的作用机制研究

发布时间：2020-10-13 02:30

　　 隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)是特殊的HBV感染形式。由于OBI携带者血液中HBsAg呈阴性,因而临床上很少被识别,也未纳入乙肝诊疗的范围。但是越来越多的证据表明其可能影响HBV慢性感染的结局,甚至导致肝癌的发生。关于OBI的发生机制未有定论,其中可能的因素为病毒本身的改变,因此本研究基于前期大量样本的分析,从病毒角度探索HBVS蛋白的突变和修饰在OBI发生中的作用。2010年1月至2013年12月间,本实验室收集了来自全国各地29个血站的1261份HBsAg-/HBVDNA+献血者样本,确认了其中982例为OBI。我们对970例信息完全的OBI献血者宿主或病毒信息进行统计分析,并按照血清学状态进行分组统计。随机抽取275份OBI样本进行S区测序,成功测序116份。同期还在同一人群中成功测序530份HBsAg阳性样本用作对照组。本研究从S蛋白的糖基化和跨膜结构域突变两个方面对116份OBI和531份对照序列比对分析,识别候选突变并对候选突变进行功能验证。研究方法采用定点突变技术将候选突变引入目标野生型质粒,并转染到huh-7表达,检测细胞内外表面抗原的水平,并用WB进行验证。结果显示970例确认的OBI献血者男性占70%,重复献血者占39.7%,中位年龄为40岁(范围18-60岁),未见ALT异常案例。绝大部分(69.1%)样本的HBV DNA 水平低于 12 IU/mL。血清学模式分为 anti-HBc+/anti-HBs-占 68%(659),anti-HBc+/anti-HBs+占 25%(242),anti-HBc-/anti-HBs+占 7%(69)。测序结果分析发现,OBI组S蛋白糖基化突变(40.7%vs 11.8%,P0.001)和TMD区亲水性氨基酸替换频率(65%vs 25%,P0.001)高于HBsAg阳性对照组。我们选取MHR区的7个位点的9个新增糖基化突变和3个废除糖基化突变进行功能验证。WB结果显示除了 GSS112-114NAT其他突变全部成功引进新的糖基。在质粒M88和p38.Ⅱ上,除了 TCT123-125NCT/NFT,其他突变并未显著改变胞外HBsAg水平。对于质粒M86,所有新增糖基化突变导致胞外HBsAg下降到野生型的1/10甚至1/1000,废除146位点糖基化突变导致胞外HBsAg上升至10倍左右,分泌效率(胞内胞外HBsAg之比)与胞外HBsAg有一致的变化。另外,我们选取TMD1-3区7个R替换进行功能验证,结果表明TMD2中的R替换使胞外胞内HBsAg降至检测限以下,而TMD1和TMD3中的R替换没有导致HBsAg显著变化。综上,新增糖基化突变通过阻碍分泌而导致胞外HBsAg下降,TMD2区的亲水性氨基酸替换导致胞内外极低的HBsAg水平,从而导致血液循环中无法检测到HBsAg,因而很可能是OBI的发生的机制之一。本研究为更全面的阐明病毒因素在OBI发生中发挥的作用提供了新的角度和证据,为OBI的深入研究奠定基础。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

在且具有致病性及传染性。当感染者处于免疫抑制状态下，ＨＢＶ再激活的出现??也是ＯＢＩ的一大临床危害［７，８］。另外，动物实验和人群分析等多项研宄都证明ＯＢＩ??是发生慢性肝脏疾病和肝癌的重要危险因素（图１）。??但由于ＯＢＩ感染者无症状或者症状不明显，且血清ＨＢｓＡｇ阴性，ＨＢＶＤＮＡ??含量极低，很难被发现，因此相关临床研宄受到限制。血清学检测，尤其是ＨＢｓＡｇ??检测一直是一项重要的血液筛查手段，但随着对输血安全越来越高的要求，以及对??ＯＢＩ这一特殊感染状态的认识，单纯的血清学检测的灵敏度已经不能满足控制ＨＢＶ??输血传播风险的需求。因此２００４年起核酸检测（Ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｔｅｓｔ，?ＮＡＴ）开始在发??达国家血液中心得到应用。２０１０年起，ＮＡＴ开始在我国各血站得到应用，国家卫??生健康委临床检验中心（原卫生部临床检验中心）同时开始对全国血站ＮＡＴ检测??５??

转录后机制和翻译后修饰的研究更少。??Ｓ区除了?ＭＨＲ，剩余部分组成了?４个跨膜结构域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ?ｄｏｍａｉｎｓ，??ＴＭＤｓ）和一个外膜内ｌｏｏｐ?（图２）。ＴＭＤ的结构及位置见图２，?ＴＭＤ?１?（ａａ４？ａａ２３）??和ＴＭＤ?２?（ａａ８１？９９）是已被证实的两个跨膜结构域，而１６０－２２６这一区域的拓扑??结构还未证实，但是这一区域绝大部分是疏水性的，尤其富含芳香族氨基酸，因此??推测这一区域包含两个ａ螺旋，形成两个ＴＭＤ，?ＴＭＤ３（ａａｌ６０？ａａｌ９３）和ＴＭＤ４??（ａａ２０２？ａａ２２２）＿。ＴＭＤ绝大部分由疏水性氨基酸组成，这种疏水特性使其插入脂??质双分子层，从而将Ｓ蛋白铆钉在病毒外膜上。因此，ＴＭＤ的疏水特性一旦受到??破坏很可能对Ｓ蛋白的结构和功能产生重要影响而导致血液循环中不可检测到的??ＨＢｓＡｇ，可能导致ＯＢＩ的发生［２３］。ＳｕｂｈａｊｉｔＢｉｓｗａｓ等发现ＴＭＤ?３区的Ｐ１７８Ｒ突变??导致ＨＢｓＡｇ分泌受阻，从而使胞外ＨＢｓＡｇ呈低水平［１４］，?ＯＢＩ中ＴＭＤ区其他突变??至今尚未见报道

?ＴＣＴ１２３－１２５ＮＦＴ，?ＧＴＳ１３０－１３２ＮＴＳ，?ＴＳＭ１３１－１３３ＮＳＳ，?ＴＳＭ１３１－１３３ＮＳＴ，??ＴＳＭ１３１－１３３ＮＹＴ，废除糖基化包括ＮＣＴ１４６－１４８ＤＣＴ，详见图３。基因型Ｃ中识别??出的新增糖基化突变包括：ＴＴＳ１１５－１１７ＮＴＳ，ＴＣＴ１２３－１２５ＮＣＴ，ＧＴＳ１３０－１３２ＮＴＳ，??ＴＳＭ１３１－１３３ＮＳＴ，?ＴＳＭ１３１－１３３ＮＹＴ，废除糖基化包括?ＮＣＴ１４６－１４８ＤＣＴ／ＳＣＴ／ＹＣＴ，??详见图４。??精氨酸侧链均有氨基，在非碱性环境中以－ＮＨ３＋存在，是带有大正电荷的亲水??性氨基酸，亲水性在所有氨基酸中最高，最可能破坏ＴＭＤ的疏水特性。因此，识??别４个ＴＭＤ区的Ｒ替换进行功能验证。基因型Ｂ中包括：ＴＭＤ１区Ｑ１６Ｒ，ＴＭＤ２??区Ｃ８５Ｒ和Ｌ８８Ｒ，ＴＭＤ３区Ｑ１８１Ｒ和Ｗ１８２Ｒ，详见图３。基因型Ｃ中包括：ＴＭＤ２??区?Ｌ８７Ｒ?和?Ｃ９０Ｒ，ＴＭＤ３?区?Ｑ１８１Ｒ?和?Ｗ１８２Ｒ，详见图?４。??４?
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本文编号：2838612